我國(guó)部分地區(qū)不同來(lái)源副溶血弧菌的分子分型及遺傳變異研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus,Vp)為一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌,是引起食源性疾病的重要病原之一。每年由Vp引起的食物中毒事件在世界各地均有報(bào)道,特別是在亞洲。我國(guó)衛(wèi)生部疫情直報(bào)系統(tǒng)(http://www.moh.gov.cn/publicfiles//business/htmlfiles/mohwsyjbgs/index.htm)監(jiān)測(cè)顯示,在2009～2011年期間Vp是引起細(xì)菌性食物中毒事件的首要病因。已知副

2、溶血弧菌有12種O抗原及76種K抗原,自1996年,世界各地出現(xiàn)了一種O3:K6大流行克隆株,該型別菌株具有較強(qiáng)的傳播能力和致病性。除了O3:K6外,O4:K8、O4:K68、O1:K25、O3:K29和O1:K56等也是臨床常見血清型。相對(duì)臨床菌株,環(huán)境和食品中分離的副溶血弧菌的血清型組合復(fù)雜多變。而在我國(guó)不同地區(qū)、不同來(lái)源菌株的血清型分布、毒力特點(diǎn)、基因型別特征和遺傳進(jìn)化關(guān)系,以及臨床與環(huán)境分離株的區(qū)別與聯(lián)系,我們并不完全了解。

3、r>　　為了明確上述問題,本研究基于軍隊(duì)傳染病病原監(jiān)測(cè)平臺(tái),自2010～2011年期間共收集上海、沈陽(yáng)和北京地區(qū)不同來(lái)源的副溶血弧菌206株,通過(guò)生化鑒定、血清分型和分子生物學(xué)技術(shù),分析我國(guó)三個(gè)不同地區(qū)、不同來(lái)源Vp菌株的血清型分布及毒力基因攜帶情況;利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(Multilocussequencetyping,MLST)和多位點(diǎn)可變數(shù)目串

4、聯(lián)重復(fù)序列分析(Multilocusvariablenumbertandemrepeatanalysis,MLVA)等分子分型方法,對(duì)上述Vp菌株進(jìn)行分子分型研究,分析不同地區(qū)、不同來(lái)源、不同血清型Vp菌株的基因型差異與親緣關(guān)系及其變異進(jìn)化規(guī)律,特別是分析了新血清型Vp菌株的基因型特征,探討臨床感染分離株與環(huán)境或食品來(lái)源分離株的遺傳相關(guān)性,為弧菌引起的食源性傳染病的網(wǎng)絡(luò)化監(jiān)測(cè)、預(yù)警、暴發(fā)溯源提供技術(shù)支持,為建立全軍食品污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)和全軍

5、食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究對(duì)象來(lái)自于三個(gè)地區(qū)分離鑒定的Vp菌株206株,包括臨床病人分離155株,環(huán)境或食品分離菌51株。其中沈陽(yáng)地區(qū)51株,均為臨床病人分離;北京地區(qū)15株臨床菌株8株,食品分離株7株;上海地區(qū)140株,食品中檢測(cè)到44株,臨床株96株。并監(jiān)測(cè)到3起食物中毒事件,從中分離菌株32株。
　　血清分型顯示,對(duì)206株菌共分出42種血清型,其中14種血清型組合為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。優(yōu)勢(shì)型別為O3:K6,占

6、45.6％,3起食物中毒暴發(fā)亦由此型別引起。155株臨床菌株,共分為25種血清型。除了O3:K6外,還檢測(cè)到O4:K8、O4:K68、O1:K25和O3:K29等國(guó)內(nèi)外臨床上經(jīng)常報(bào)道的幾種血清組合型,以及在臨床上很少報(bào)道的O3:K25、O1:K56等14種血清組合型。此外,本研究還首次發(fā)現(xiàn)了O3:K8、O3:K9、O2:K53、O3:K13、O5:K6、O2:KUT和O4:KUT這7種引起臨床感染的血清組合型。而環(huán)境菌株中血清型復(fù)雜多變

7、,51株菌分為25種血清型,包含O7:KUT、O3:K8、O10:K6、O2:K8、O1:K6、O3:K13、O10:K22、O2:K24、O4:KUT和O4:K18等10種國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道的血清型。值得關(guān)注的是,O1:KUT、O3:K6、O3:K7、O3:K8、O3:K13、O3:KUT、O4:KUT和O10:KUT為環(huán)境和臨床分離株共有的血清型,提示臨床感染與環(huán)境污染具有相關(guān)性。
　　對(duì)206株Vp菌株的tdh(thermost

8、abledirecthemolysin)、tl(thermolabilehemolysin)、trh(thermostabledirecthemolysin-relatedhemolysin)、toxR和flaE等5種毒力基因進(jìn)行篩檢,結(jié)果顯示,所有菌株均含有tl基因;除了沈陽(yáng)地區(qū)一株菌不含toxR和flaE基因外,其余菌株均攜帶toxR和flaE基因;trh基因只有2株菌為陽(yáng)性;70.9%(146株菌)的菌株含tdh基因。在155株臨

9、床分離株中,145株tdh基因陽(yáng)性,陽(yáng)性率為93.5%;而環(huán)境株只有一株陽(yáng)性。本研究發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)臨床株O3:K6均為toxR+tdh+tl+trh-的大流行菌株,占所有臨床菌株的76.1%。此外,值得關(guān)注的是,環(huán)境和臨床分離株共有的血清型中,O3:K6均含有tdh基因,而O10:KUT均不含tdh基因,其余血清型如O1:KUT、O3:K7、O3:K8、O3:K13、O3:KUT和O4:KUT其臨床株含tdh基因,環(huán)境株卻為陰性。以上分析說(shuō)明

10、,tdh基因是鑒別有毒株與無(wú)毒株的標(biāo)志因子,而本研究中極少數(shù)臨床菌株tdh基因陰性,這可能與其在傳代過(guò)程中丟失了tdh基因有關(guān),具體原因還有待深入探究。
　　采用國(guó)際腸道病原菌分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)PulseNet推薦的PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法,對(duì)191株副溶血弧菌基因型進(jìn)行分析。PFGE圖譜型導(dǎo)入BioNumerics(Version6.0)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件中進(jìn)行聚類分析。相似度系數(shù)采用Dice系數(shù),聚類方法為UPGMA,位置差異容許度設(shè)置為1.5

11、%。191株副溶血弧菌共生成111個(gè)PFGE圖譜型,按62%cutoff值將其分成十大聚類(一至十),其中聚類三為主要聚類。該聚類又可分成A和B兩個(gè)亞聚類。亞類A包含104株菌,占所有菌株的54.5%,主要為臨床菌株,只存在2株環(huán)境菌株。該亞類中,O3抗原血清型菌株占94%,包括所有的O3:K6和O4:K68血清型菌株及O1:KUT和O3:K25菌株,說(shuō)明O4:K68、O1:KUT和O3:K25與O3:K6具有較近的親緣關(guān)系,可能由O3

12、:K6進(jìn)化而來(lái)。該亞類中,來(lái)自上海和沈陽(yáng)的O3:K6菌株具有明顯的地區(qū)分布,但也有極個(gè)別來(lái)自這兩個(gè)地區(qū)的O3:K6菌株具有相同的圖譜型,這說(shuō)明O3:K6菌株可能存在跨地區(qū)傳播,在傳播過(guò)程中為了適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境而發(fā)生了變異。聚類五共有40株菌,以環(huán)境分離株為主(占72.5%),其圖譜型差異較大。但是,在該聚類中,1株臨床分離的新血清型O5:K6菌株與環(huán)境分離的2株O5:KUT和1株O5:K17菌株具有相同圖譜型,這說(shuō)明這3種血清型可能具有較近

13、的親緣關(guān)系。
　　應(yīng)用PubMLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)提供的標(biāo)準(zhǔn)方案對(duì)201株Vp菌株進(jìn)行MLST分析,共分為63個(gè)STs,其中鑒定出90個(gè)新的等位基因值和48個(gè)新的序列型(Sequencetypes,STs),新STs占76.2%,這說(shuō)明Vp菌株具有一定的遺傳多態(tài)性,同時(shí)也說(shuō)明了Vp菌株的易變異性。O3:K6、O3:KUT、O4:K68、O3:K25、O1:K

14、6和O1:KUT等6個(gè)血清型共計(jì)111株菌均屬于ST3,這說(shuō)明了O4:K68、O3:K25和O3:KUT等血清型可能由O3:K6通過(guò)其O抗原和K抗原的突變而遺傳進(jìn)化而來(lái)。本研究還發(fā)現(xiàn)了14株O4:K8和1株O3:K8菌PFGE圖譜型相同,且同屬于新序列型ST478,其recA位點(diǎn)基因大小比預(yù)期值大,很可能與其它弧菌發(fā)生了遺傳重組,同時(shí)也說(shuō)明O3:K8可能由O4:K8遺傳進(jìn)化而來(lái)。eBURST進(jìn)化分析顯示,ST3為所有STs的Founde

15、r,其包含12個(gè)SLVs和5個(gè)DLVs(Doublelocusvariant),這些STs組成一個(gè)大的克隆群(ClonalComplex,CC)。48個(gè)新序列型中,ST331、332、333、433、434、435、444、447、448、452、472和478等12個(gè)STs具有SLVs或DLVs,其它STs均為Singletons,即與ST3遺傳距離較遠(yuǎn)。
　　此外,本研究從14個(gè)VNTR位點(diǎn)中篩選了8個(gè)多態(tài)性較好的位點(diǎn),對(duì)20

16、4株菌進(jìn)行了MLVA分析。204株Vp菌株被分為156個(gè)型別,其中92株O3:K6血清型菌株,被分為59個(gè)型別,這說(shuō)明Vp菌株具有遺傳多態(tài)性,也證明了本研究建立的MLVA技術(shù)的分辨率明顯高于PFGE和MLST。聚類分析結(jié)果顯示,相同血清型菌株一般具有相同VNTR型別或聚在一起,也有一些菌株具有相同的血清型,其MLVA型別卻差異較大,即可能具有不同的流行克隆或具有不同進(jìn)化起源。O4:K68、O3:K25、O3:KUT、O1:KUT和O1:

17、K33等血清型菌株與O3:K6血清型菌株聚類一起,說(shuō)明這些型別可能由O3:K6遺傳進(jìn)化而來(lái)。對(duì)于O3:K6和O4:K8這兩種臨床常見血清型而言,其VNTR型別具有明顯的地區(qū)差異。以上分析為將來(lái)Vp引起的感染或食物中毒暴發(fā)的溯源調(diào)查提供了依據(jù)。MST(Minimumspanningtree)進(jìn)化分析顯示,O3:K6為其它血清型菌株的祖先,即其它血清型菌株可能由O3:K6遺傳進(jìn)化而來(lái)。
　　通過(guò)以上分析,本研究獲得了以下有意義的研究結(jié)

18、果:①初步分析了我國(guó)不同地區(qū)、不同來(lái)源Vp菌株的血清型別特征,并在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)了14種新的血清組合,其中包含7種可引起臨床感染的血清型;②分析了環(huán)境與臨床不同來(lái)源Vp菌株的毒力基因攜帶情況,認(rèn)為tdh基因可作為區(qū)別有毒株與無(wú)毒株的標(biāo)識(shí);③采用PFGE、MLST和MLVA等3種分子分型方法對(duì)收集的Vp菌株進(jìn)行了分析,檢測(cè)到90個(gè)新的等位基因值和48個(gè)新STs,發(fā)現(xiàn)了recA管家基因的重組現(xiàn)象,這反映了Vp菌株的易變異性;④通過(guò)分子分型分

19、析,發(fā)現(xiàn)Vp具有遺傳多態(tài)性,且環(huán)境分離株的多態(tài)性高于臨床分離株。遺傳進(jìn)化分析顯示,O4:K68、O3:K25、O3:KUT和O1:KUT等血清型可能由O3:K6遺傳進(jìn)化而來(lái);⑤為Vp臨床感染與環(huán)境或食品污染的相關(guān)性提供了一定數(shù)據(jù)支持;
　　本研究所建立的分型方法和所獲得的核酸指紋基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為食源性傳染病病原的鑒定溯源、新型病原的發(fā)現(xiàn)、食物中毒事件的確認(rèn)及流行病學(xué)調(diào)查、病原體遺傳變異以及種群進(jìn)化分析提供了技術(shù)支持,并為軍隊(duì)傳染病病原