不同防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜抑制和清除作用的研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）是嗜鹽性、革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海水、河口環(huán)境中，特別是海鮮類和鹽漬類的產(chǎn)品中，是一種重要的食源性致病菌，可引起食物中毒和急性腹瀉病。生物膜是微生物細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞外大分子多聚物所形成的一種特殊細(xì)菌群落，它也是細(xì)菌抵抗不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致持續(xù)感染的重要方式。生物膜一旦形成，使用一般的抗生素、消毒劑很難去除，在醫(yī)療和食品安全等領(lǐng)域帶來很大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)天然的、安全的

2、抗生物膜制劑具有重要的意義。
　　本研究采用結(jié)晶紫染色法、平板菌落計(jì)數(shù)、微量肉湯二倍稀釋法、XTT減量法、苯酚-硫酸法、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察等方法，分析不同條件下副溶血弧菌生物膜的形成特性和食品防腐劑處理對(duì)生物膜的抑制和清除作用。研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.以副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802、J5421以及實(shí)驗(yàn)室分離鑒定得到的24株副溶血弧菌作為研究對(duì)象，分析其形成生物膜的能力，結(jié)果21號(hào)菌株和22號(hào)

3、菌株成膜能力較強(qiáng)。選擇副溶血弧菌ATCC17802、J5421和21號(hào)、22號(hào)菌株為研究對(duì)象，分析不同菌株、時(shí)間、溫度、pH、鹽濃度、材料等因素對(duì)生物膜的形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，四株菌的成膜能力均最高。pH在5～9時(shí)有利于副溶血弧菌生物膜形成。高濃度的NaCl有利于副溶血弧菌ATCC17802、J5421、22號(hào)菌株生物膜的形成，其中添加3％的NaCl時(shí)生物膜形成量最高；低濃度的NaCl有利于副溶血弧菌21號(hào)菌株生物膜

4、的形成，其中添加1.5%的NaCl生物膜形成量最高。比較四種不同的材料（玻片、不銹鋼片、蟹殼、魚鱗）上副溶血弧菌粘附能力，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌在蟹殼上粘附能力最強(qiáng)。
　　2.進(jìn)一步研究殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和ε-聚賴氨酸（ε-PL）對(duì)副溶血弧菌ATCC17802和J5421菌株生物膜的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)副溶血弧菌的抑菌能力最強(qiáng)，其MIC和MBC分別為1.25 mg/mL和2.5 mg/mL；經(jīng)過1/2MIC、1/4MIC、

5、1/8MIC殼聚糖溶液處理后，其抑制率分別為68.37%、34.12%、14.38%；菌體的代謝活性抑制率分別為47.74%、34.34%和17.17%；胞外多糖抑制率為76.32%、62.57%和29.38%。結(jié)果表明亞抑菌濃度下的殼聚糖能夠明顯抑制生物膜的形成，降低細(xì)菌的代謝活性。經(jīng)1/2MIC殼聚糖+1/4MIC山梨酸鉀+1/2MIC脫氫乙酸鈉+1/4MICε-聚賴氨酸復(fù)配后對(duì)生物膜的抑制率達(dá)到79.54%，菌體的代謝活性抑制率為

6、59.72%，胞外多糖抑制率為85.44%。亞抑菌濃度的防腐劑之間復(fù)配顯著增強(qiáng)了單獨(dú)使用一種防腐劑對(duì)生物膜的抑制效果。
　　3.分析研究了殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和ε-聚賴氨酸（ε-PL）對(duì)副溶血弧菌ATCC17802和J5421菌株生物膜的清除作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4MIC、2MIC、MIC殼聚糖溶液處理4 h后，其清除率分別達(dá)到86.94%、61.43%、46.94%；菌體的代謝活性減少率分別為76.10%、63.11%、52

7、.20%；胞外多糖減少率為81.43%、69.63%、61.12%。結(jié)果表明殼聚糖對(duì)副溶血弧菌的清除效果最強(qiáng)，隨著殼聚糖濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，殼聚糖對(duì)副溶血弧菌生物膜的清除作用顯著增強(qiáng)。高濃度的殼聚糖可以有效的清除成熟的生物膜。進(jìn)一步通過4MIC殼聚糖+MIC山梨酸鉀+2MIC脫氫乙酸鈉+2MICε-聚賴氨酸復(fù)配大大增強(qiáng)了清除成熟生物膜的效果。防腐劑復(fù)配對(duì)成熟生物膜的菌體殺菌率為96.34%，代謝活性減少率為85.64%，胞外多