番茄microRNA及其靶基因?qū)追N病毒侵染的反應(yīng).pdf

1、miRNA是一類長(zhǎng)度在21-24個(gè)堿基的小分子RNA，廣泛存在植物組織中。它是植物中一個(gè)重要的基因調(diào)控機(jī)制，miRNA基因沉默途徑中的重要組成部分。它們通過(guò)與AGO及其它蛋白的作用，形成具有攻擊功能的miRNA基因沉默復(fù)合體(miRISC)，利用其本身的堿基互補(bǔ)功能，miRISC可以對(duì)它們的目標(biāo)基因的mRNA進(jìn)行剪切降解、翻譯抑制等作用，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控目的。miRNA基因沉默作用是植物自身進(jìn)行功能調(diào)控和抵御外來(lái)威脅的有效方

2、法。
　　 目前發(fā)現(xiàn)的植物miRNA有幾十個(gè)家族，它們的功能多種多樣，其中不僅有植物體形態(tài)形成，更包括了葉的發(fā)育、花的形成、組織分化和器官的形成、水分和礦物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、小RNA代謝調(diào)控以及環(huán)境脅迫應(yīng)答等多方面的作用。可以說(shuō)，植物大量miRNA家族具有龐大而復(fù)雜的功能體系。在植物的不同發(fā)育時(shí)期、不同的環(huán)境條件下，miRNA的表達(dá)會(huì)有較大的差異。而在植物的不同組織中，各個(gè)miRNA家族又各自發(fā)揮著自己的獨(dú)特功能，形成較大的表達(dá)差異。因

3、此，要對(duì)植物miRNA途徑進(jìn)行了解，就不得不考慮到植物各發(fā)育的階段下、植物所處的不同環(huán)境中以及特異性的組織中的miRNA代謝水平。
　　 近年來(lái)，通過(guò)病毒對(duì)植物的侵染來(lái)研究植物的小RNA代謝過(guò)程的研究越來(lái)越多，人們逐漸地意識(shí)到，利用病毒作為一個(gè)外來(lái)脅迫因子來(lái)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾，然后利用植物與病毒之間的相互作用關(guān)系，來(lái)研究植物和病毒小RNA代謝過(guò)程是一種較為新穎有效的了解miRNA作用方式和植物抗病機(jī)制的一種實(shí)驗(yàn)策略。
　　

4、 當(dāng)被病毒侵染時(shí)，植物自身的siRNA基因沉默途徑剪切和抑制病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)，為應(yīng)對(duì)植物這一防御機(jī)制，病毒進(jìn)化出一套反防御策略。該策略以沉默抑制子為主體，針對(duì)植物siRNA基因沉默途徑進(jìn)行攻擊。然而，由于siRNA基因沉默途徑和miRNA基因沉默途徑具有某些共同的生理生化過(guò)程，miRNA代謝過(guò)程也同樣受到病毒的干擾。miRNA不能行使其正常的生物學(xué)功能，最終導(dǎo)致植物在生理功能上發(fā)生異常，植物的病毒侵染癥狀也隨即出現(xiàn)。
　　

5、 黃瓜花葉病毒(Cucumbe.mosai.virus，CMV)和番茄不孕病毒(Tomatoasperm.virus，TAV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員。CMV和TAV對(duì)植物均具有較強(qiáng)的侵染作用，CMV引起的番茄病毒病十分普遍和嚴(yán)重，已經(jīng)成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的最主要病害之一。TAV與CMV具有相近的基因組結(jié)構(gòu)，在侵染方式等方面與CMV具有較大的相似性。它們所共同具有

6、的2b蛋白已被確定是典型的沉默抑制子，是植物侵染過(guò)程中的主要致病因子。通過(guò)觀察這兩種病毒侵染植物時(shí)的寄主癥狀，檢測(cè)miRNA和miRNA靶基因的表達(dá)量，人們可以對(duì)miRNA在植物生理功能調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行深一步的了解。
　　 本實(shí)驗(yàn)中，我們首先利用常用的3'-RACE和克隆的方法對(duì)番茄中可能存在的miRNA的靶基因mRNA序列進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證。得到了miR167的靶基因ARF8的序列和miR168的靶基因AGO1的兩個(gè)序列。再選用不

7、同毒力、不同癥狀的CMV株系和TAV侵染番茄，利用stem-loop熒光定量RT-PCR分析了三個(gè)不同侵染時(shí)期，四個(gè)不同組織miRNA及其5條靶基因mRNA的對(duì)病毒侵染的響應(yīng)，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析表明，對(duì)于miRNA及其靶基因mRNA的表達(dá)量：1)寄主植物不同的組織中的表達(dá)量有明顯差異；2)不同病毒侵染植物時(shí)造成的表達(dá)量差異因所侵染的病毒不同而有所不同；3)表達(dá)量還因寄主被侵染病毒的時(shí)間長(zhǎng)短而有所差異。
　　 以上結(jié)果表明，病毒對(duì)寄

8、主miRNA調(diào)控途徑對(duì)影響具有組織特異性，不同病毒對(duì)miRNA調(diào)控途徑對(duì)影響程度也有差別。這些都向我們說(shuō)明了一個(gè)普遍存在于植物與病毒的問(wèn)題：病毒通過(guò)影響寄主miRNAs調(diào)控途徑來(lái)干擾寄主功能基因的表達(dá)，參與影響寄主癥狀的和影響寄主正常發(fā)育和形態(tài)建成。
　　 通過(guò)以上研究，我們分析了病毒侵染后寄主不同組織中miRNAs及其靶標(biāo)mRNAs對(duì)表達(dá)量變化，探討了不同病毒與寄主互作過(guò)程中，寄主miRNAs調(diào)控途徑的改變和影響。這其中所表現(xiàn)