葡萄microRNA164和microRNA171調(diào)控其靶基因的功能分析.pdf

1、葡萄（Vitis vinifera L.）是世界性重要水果之一，也是我國重要經(jīng)濟果樹之一，全世界產(chǎn)量僅次于柑橘。它是第一個完成全基因組測序的果樹樹種。轉(zhuǎn)錄因子和miRNA對于植物的生長發(fā)育及逆境應(yīng)答等具有重要的作用。本研究以‘夏黑’和‘藤稔’葡萄為研究材料，利用生物信息學(xué)、qRT-PCR、PPM-RACE、RLM-RACE、轉(zhuǎn)基因、高通量測序等技術(shù)開展了葡萄microRNA164(miR164)和microRNA171(miR171)的

2、進化、NAC和GRAS轉(zhuǎn)錄因子的挖掘功能分析、miR164和miR171調(diào)控NAC和GRAS基因的作用模式、葡萄miR164、miR171及其它miRNAs在花芽中的表達分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了葡萄、擬南芥、楊樹、蘋果、水稻、玉米miR164家族不同成員成熟體和前體序列的系統(tǒng)進化關(guān)系對其保守的程度和范圍進行研究。雖然miR164成熟體序列具有很高的保守性，但還是存在關(guān)鍵序列的變異導(dǎo)致了功能的多樣化。系統(tǒng)發(fā)育分析表明

3、6中植物的miR164家族的古老和近期的譜系存在多樣化的組合。miR164基因上游啟動子區(qū)域的順式調(diào)控元件的保守性與特異性表明其表達方式和功能存在分化。構(gòu)建了葡萄、擬南芥、楊樹、水稻(osa) miR171家族不同成員成熟體和前體序列的系統(tǒng)進化關(guān)系對其保守的程度和范圍進行研究。雖然miR171成熟體序列的保守性高達80％，但還是存在關(guān)鍵序列的變異導(dǎo)致了功能的多樣化，例如ptc-miR171j-1，-m;osa-miR171g，-h，-i

4、其靶基因不是SCL基因。系統(tǒng)發(fā)育分析表明4中植物的miR171家族的古老和近期的譜系存在多樣化的組合。miR171基因上游啟動子區(qū)域具有類似的順式調(diào)控元件，這能夠表明miR171家族內(nèi)部功能多樣化的原因。
　　2.對葡萄143條NAC蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生和NAC基因組定位進行分析，然后對其氨基酸組成成分、理化性質(zhì)以及二級和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和分析，同時還分析了葡萄與擬南芥的NAC基因家族之間的聯(lián)系。結(jié)果顯示這143條蛋白序列與擬南芥9

5、4個NAC基因蛋白序列一起分成了16個亞族，說明擬南芥與葡萄NAC基因間具有較高的保守性;基因組定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)143條NAC基因分布在17條染色體上。研究還發(fā)現(xiàn)不同亞家族間氨基酸數(shù)目、氨基酸序列間的疏水性存在一定的差異;而對它們的二級結(jié)構(gòu)都主要以隨機卷曲為組成部分，且143條氨基酸序列三維結(jié)構(gòu)十分相似。從12×葡萄基因組數(shù)庫中預(yù)測得到了43個GRAS基因。對GRAS基因的基因重復(fù)模式、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育等進行了研究。為了更好的認識GRAS

6、基因在葡萄發(fā)育過程中的功能，對GRAS家族各個基因在果實、葉片、花、卷須、根、莖等組織中的表達利用qRT-PCR進行了分析。為了確定GRAS基因?qū)γ{迫的應(yīng)答反應(yīng)，利用公共芯片數(shù)據(jù)庫信息獲得了其在生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達情況，一些GRAS基因在受到脅迫后上調(diào)或下調(diào)表達。預(yù)測得到了4條屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的miR164靶基因和2條屬于GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的mIR171靶基因。
　　3.利用PPM-RACE和RLM-RACE驗

7、證了葡萄miR164和miR171的兩個靶基因。結(jié)果不僅確定了miRNA的切割位點，還呈現(xiàn)出裂解產(chǎn)物的表達模式，進而說明miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)功能。靶基因的表達模式和miRNA的表達模式存的不同表明miRNA對靶基因的裂解。構(gòu)建VvSCL15的超表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株與野生型擬南芥相比滲透脅迫的敏感性提高，VvSCL15能夠降低了擬南芥對滲透脅迫的抗性。
　　4.休眠期是葡萄花芽分化是一個關(guān)鍵時期，有關(guān)休眠階段葡萄花芽

8、的miRNAs相關(guān)研究尚未見報道。本研究以‘藤稔’葡萄為試材構(gòu)建休眠階段頂部節(jié)位花芽和底部節(jié)位花芽兩個miRNA文庫。通過高通量測序技術(shù)對兩個文庫的小RNA進行挖掘。經(jīng)過篩選，具有2個miR164家族成員和4個miR171家族成員被檢測到。miR164d對于頂部芽和底部芽發(fā)育漸趨同步具有重要作用，雖然miR171家族不同成員在頂部芽和底部芽中表達量無差距，但其表達量較高也說明miR171對花芽的分化具有一定的作用。此外兩個文庫共得到79