稻曲病菌T-DNA插入突變體B1178、B3277側(cè)翼致病相關(guān)基因的克隆及功能初步分析.pdf

1、稻曲病是由水稻中的病原真菌稻曲病菌導(dǎo)致。本文研究是基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(ATMT)技術(shù)。構(gòu)建了一個(gè)稻曲病菌突變體庫(kù)，其出發(fā)菌株為P1。通過(guò)分析了一個(gè)突變菌株B3277，在稻曲病菌庫(kù)中由于T-DNA插入致病性增強(qiáng)，為解析稻曲病菌的致病分子機(jī)理提供方法基礎(chǔ)。統(tǒng)計(jì)分析突變菌株B3277的生物學(xué)性狀，致病性，生長(zhǎng)速率，產(chǎn)孢能力等。發(fā)現(xiàn)與野生菌株P(guān)1相比，突變菌株B3277在固體培養(yǎng)基PSA、TB3和MM上的生長(zhǎng)速率和在液體PS培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢能力

2、均有下降，但其在田間的致病性卻顯著增強(qiáng)。經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增T-DNA中的基因GFP和HPH，驗(yàn)證了T-DNA已插入在B3277的基因組DNA中。同時(shí)利用Southern blot雜交技術(shù)，分析在外源基因B3277基因組DNA的插入，判斷T-DNA拷貝。結(jié)果表明，T-DNA是以單拷貝的形式插入在B3277基因組DNA中。運(yùn)用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得B3277中T-DNA側(cè)翼兩端的稻曲序列，長(zhǎng)度分別為258bp(U.VLB)和347b

3、p(U.VRB)，T-DNA的LB端序列只丟失了66bp，相反RB端大部分丟失，只剩下55bp。突變菌株B3277致病力增強(qiáng)，且T-DNA的RB和LB均有丟失，推測(cè)原因可能是由于T-DNA的插入導(dǎo)致。
　　根據(jù)hiTAIL-PCR獲得T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)結(jié)合RACE-PCR技術(shù)克隆T-DNA側(cè)翼基因全長(zhǎng)，獲得一個(gè)側(cè)翼基因Uvt3277，T-DNA插入在基因中間。對(duì)Uvt3277進(jìn)行生物信息學(xué)方面的分析，發(fā)現(xiàn)其

4、與一些真菌中的低親和力鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有很高分的同源性。在PSA培養(yǎng)基上測(cè)定B3277對(duì)FeSO4的吸收能力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)能夠利用FeSO4正常生長(zhǎng)，P1則會(huì)受到抑制生長(zhǎng)減慢，推測(cè)該突變體缺失基因與亞鐵離子有關(guān)。半定量RT-PCR分析基因表達(dá)情況，結(jié)果表明，Uvt3277在B3277中與P1相比不表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果獲得了一個(gè)突變稻曲病菌B3277的T-DNA側(cè)翼的基因Uvt3277（GeneBank登錄號(hào)No.:KJ158162），

5、且與低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)，推斷該基因在稻曲病菌致病過(guò)程中起著重要作用，為解析稻曲病菌的致病分子機(jī)理提供了重要線索。
　　通過(guò)分析稻曲病菌T-DNA插入突變體庫(kù)中致病力減弱的突變菌株B1178，統(tǒng)計(jì)分析了突變菌株B1178的生長(zhǎng)速率，產(chǎn)孢能力、致病力等生物學(xué)性狀。發(fā)現(xiàn)與野生菌株P(guān)1相比，突變菌株B1178在固體培養(yǎng)基PSA、TB3和MM上的生長(zhǎng)速率和在液體PS培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢能力均有下降，并且在田間的致病性也下降。
　　經(jīng)PCR

6、技術(shù)擴(kuò)增T-DNA中的基因GFP和HPH，驗(yàn)證了T-DNA已插入在B1178的基因組DNA中。同時(shí)利用Southern雜交技術(shù)分析B1178外源基因插入的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示T-DNA在B1178中是單拷貝的形式插入。運(yùn)用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得B1178中T-DNA側(cè)翼兩端的稻曲序列，長(zhǎng)度分別為291bp(U.VLB)和311bp(U.VRB)，T-DNA的LB端序列全部存在297bp，相反RB端大部分丟失，302bp中只剩下17