稻曲病菌T--DNA插入突變體B1812、B1241側(cè)翼基因克隆及Uvt--726互作因子的篩選.pdf

1、稻曲病是發(fā)生在水稻穗部的一種真菌病害，其病原菌稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）可侵染水稻小花，形成的稻曲球嚴(yán)重危及水稻的產(chǎn)量和稻米的品質(zhì)，進(jìn)而危害人類和家畜的健康?；趯?duì)稻曲病菌的形態(tài)、分離技術(shù)、孢子萌發(fā)、侵染機(jī)制等方面的研究，目前對(duì)于水稻稻曲病的防治已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，然而由于稻曲病菌的致病機(jī)制仍不明確，尚不能從根本上防治該病害。研究稻曲病菌的致病機(jī)制，有助于深入認(rèn)識(shí)和有效防控稻曲病的發(fā)生，同時(shí)對(duì)于水稻抗稻曲病品種

2、的選育具有一定的指導(dǎo)意義。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT, Agrobacterium-mediated transformationtechnology)對(duì)病原菌進(jìn)行遺傳改造，再通過表型篩選進(jìn)行基因功能的研究已經(jīng)成為一種簡便有效的方法。本實(shí)驗(yàn)室前期通過ATMT構(gòu)建了稻曲病菌P1的突變體庫，本研究以從中篩選得到致病力減弱菌株B1812和B1241為研究材料，觀察它們的生物學(xué)特性及致病情況，通過基因克隆的手段獲得了T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)

3、翼基因，并初步研究了基因的功能，為研究稻曲病菌的致病機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　1.稻曲病菌P1的T-DNA插入突變菌株B1812，其致病力、液體搖培產(chǎn)分生孢子能力與野生菌株P(guān)1相比明顯下降，且孢子明顯小于P1。而在固體培養(yǎng)基PSA和TB3菌落形態(tài)和生長速率與P1相比無顯著差異，在MM上的生長速率下降。突變菌株B1812在不含潮霉素的PSA平板上轉(zhuǎn)接5代之后，仍能擴(kuò)增到HPH基因，說明T-DNA已經(jīng)穩(wěn)定地插入到B1812的基因

4、組中。Southern雜交表明T-DNA在該突變菌株的基因組中為單拷貝。序列比對(duì)顯示，側(cè)翼基因UvHac1與UV-8b菌株中的UV8b_1075同源。UvHac1全長共2196 bp，編碼蛋白為轉(zhuǎn)錄激活因子Hac1，其中ORF為1690 bp，含有一個(gè)70 bp的內(nèi)含子，編碼539個(gè)氨基酸。5'非編碼區(qū)長為360 bp，3'非編碼區(qū)長為146 bp。分析插入位點(diǎn)側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)，突變菌株B1812的基因組在T-DNA插入位點(diǎn)處缺失了42 b

5、p。 T-DNA插入在UvHac1的5'UTR區(qū)，距起始密碼子46 bp。 qRT-PCR分析顯示該基因表達(dá)量顯著下降。經(jīng)NCBI同源性比對(duì)，UvHac1編碼蛋白Hac1含有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域bZIP。
　　2.致病力減弱突變菌株B1241在固體培養(yǎng)基MM、PSA和TB3上的菌落形態(tài)、生長速率，以及液體搖培產(chǎn)生的分生孢子形態(tài)等與P1相比無顯著差異，但分生孢子能力呈極顯著下降。T-DNA已經(jīng)穩(wěn)定地插入到B1241的基因組中且為單拷

6、貝。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，突變體中T-DNA插入位點(diǎn)處少了28 bp的稻曲病菌基因組序列，有37 bp的序列在T-DNA及稻曲病菌基因組中都沒有比對(duì)到。側(cè)翼基因UvGH18與UV-8b菌株的UV8b-7878同源，開放閱讀框長2317 bp，包含81 bp和106 bp的兩個(gè)內(nèi)含子，編碼709個(gè)氨基酸。UvGH18基因全長2650 bp，5啡編碼區(qū)長度為14 bp，3啡編碼區(qū)長度為319 bp。T-DNA插入在UvGH18的啟動(dòng)子區(qū)域，位于起

7、始密碼子之前516 bp處。qRT-PCR得知，突變體中UvGH18的表達(dá)量下降。UvGH18編碼的糖基水解酶18家族蛋白(GH18)含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域D××D×D×E。酵母雙雜交篩選稻曲病菌P1的cDNA文庫，得到4個(gè)可能與GH18互作的蛋白，分別為泛素類、小泛素相關(guān)修飾蛋白連接酶、海藻糖-6-磷酸合成酶麟酸酶和細(xì)胞形態(tài)蛋白Sog2。
　　3.Uvt-726是致病力減弱的T-DNA插入突變菌株B726通過基因克隆得到的假定基因。

8、為進(jìn)一步探究致病相關(guān)基因Uvt-726的功能，本研究通過酵母雙雜交技術(shù)篩選其互作蛋白。將目的基因Uvt-726連接至質(zhì)粒pGBKT7構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，并對(duì)誘餌蛋白進(jìn)行了毒性及自激活檢測。誘餌質(zhì)粒和文庫質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌株Y2H和Y187中進(jìn)行雜交。誘餌蛋白與BD蛋白在二倍體酵母中融合表達(dá)，與稻曲病菌P1的cDNA文庫酵母中的捕獲蛋白結(jié)合，從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。通過DDO/X/A和QDO/X/A進(jìn)行篩選，測序后與稻曲病菌全基因組進(jìn)行比