鼠雙微體2(MDM2)在醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、醛固酮(Aldosterone)是一種類(lèi)固醇激素,在機(jī)體生理及病生理活動(dòng)中起重要作用。除影響水鹽代謝及循環(huán)容量的經(jīng)典作用,近年的研究表明醛固酮還有許多重要的病生理作用,包括激活氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生及促使組織纖維化等。使用ACEI及血管緊張素受體拮抗劑后產(chǎn)生的“醛固酮逃逸”現(xiàn)象,使得醛固酮在RAS特別是局部RAS激活等一系列致病機(jī)制中的作用和地位進(jìn)一步提高。
　　 醛固酮在人體內(nèi)的作用方式包括基因組調(diào)節(jié)與非基因組調(diào)節(jié)兩

2、種?；蚪M調(diào)節(jié)是指醛固酮與鹽皮質(zhì)激素受體(MR)結(jié)合形成復(fù)合物入核,誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯,行使其生物效應(yīng)。非基因方式是指醛固酮與胞漿中的鹽皮質(zhì)激素受體或細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后通過(guò)觸發(fā)一系列第二信使的級(jí)聯(lián)反應(yīng)行使其生物效應(yīng)。由于人體內(nèi)糖皮質(zhì)激素、醛固酮與MR的親和力相當(dāng),而血漿中糖皮質(zhì)激素的濃度可達(dá)醛固酮的100—1000倍,所以能將糖皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)化以保證醛固酮與MR作用的高度特異性的11β-羥類(lèi)固醇脫氫酶(11β—HSD2)的表達(dá)是醛固酮基因

3、組調(diào)節(jié)的必要條件。
　　 醛固酮與腎臟病變關(guān)系密切,鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑具有抗蛋白尿、抗腎臟硬化的腎臟保護(hù)作用。腎小球系膜細(xì)胞增殖是目前較為公認(rèn)的醛固酮腎臟損害主要表現(xiàn)之一。細(xì)胞增殖周期的調(diào)控受促進(jìn)周期進(jìn)程的因子(如細(xì)胞周期蛋白)及抑制性因子(如p21、p53)共同影響,當(dāng)促進(jìn)周期進(jìn)程的因子增加或抑制性因子減少,系膜細(xì)胞即可增殖。有研究表明,醛固酮可通過(guò)與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合,激活一系列磷酸激酶使得S期細(xì)胞周期蛋白表達(dá)增加并激活相

4、應(yīng)Cdk酶活性,從而使細(xì)胞增殖。但醛固酮對(duì)于細(xì)胞周期抑制性因子如p53是否也存在調(diào)節(jié)作用,目前并無(wú)相關(guān)報(bào)告。從腫瘤學(xué)的研究中得知鼠雙微體2(MDM2)蛋白是一個(gè)可與p53形成復(fù)合物的核蛋白,該蛋白可以通過(guò)介導(dǎo)p53經(jīng)過(guò)泛素-蛋白酶體迅速降解而阻止p53介導(dǎo)的調(diào)亡并逆轉(zhuǎn)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞周期鎖定。有研究指出,在醛固酮介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖中存在MDM2的表達(dá)增加。MDM2是否同樣參與了醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖是本研究將探討的主要問(wèn)題。

5、r>　　 方法:
　　 以RT—PCR方法檢測(cè)人傳代系膜細(xì)胞(HMCs)及人系膜細(xì)胞株(HMCLs)有無(wú)MR、11β—HSD2、MDM2 mRNA的表達(dá)。用RT—PCR、Western Blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度、不同作用時(shí)間醛固酮對(duì)HMCs及HMCLs MDM2表達(dá)及S期細(xì)胞百分比的影響。將HMCLs分組以醛固酮、針對(duì)MDM2設(shè)計(jì)的小干擾RNA(siMDM2)、醛固酮+siMDM2刺激,檢測(cè)MDM2蛋白表達(dá)及S期細(xì)胞百

6、分比的改變以明確MDM2在醛固酮誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖中的作用。以螺內(nèi)酯(鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑)抑制試驗(yàn)檢測(cè)鹽皮質(zhì)激素受體是否參與了醛固酮誘導(dǎo)MDM2表達(dá)增加。以放線菌酮(蛋白合成抑制劑)抑制試驗(yàn)檢測(cè)醛固酮誘導(dǎo)MDM2表達(dá)是否為非基因組機(jī)制。為了解體內(nèi)醛固酮水平與系膜細(xì)胞MDM2表達(dá)關(guān)系,分別選取高醛固酮血癥患者腎活檢組織及正常腎組織,行MDM2及WT1(一種足細(xì)胞標(biāo)記性抗原)免疫組織化學(xué)染色,分析兩組間平均單位面積MDM2陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)及平均

7、單位面積WT1陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)的差異。
　　 結(jié)果:
　　 HMCs及HMCLs有MR、11β—HSD2、MDM2的表達(dá),且MDM2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核,少量表達(dá)于胞漿。醛固酮刺激可使傳代培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞MDM2蛋白表達(dá)增加,這種增加隨劑量的增加而增加,在醛固酮濃度為10-8mol/L時(shí)達(dá)峰,為陰性對(duì)照的2.725倍,P值小于0.05,具有顯著性差異。醛固酮刺激可使HMCLs的MDM2表達(dá)隨時(shí)間及劑量增加,在醛固酮濃度

8、為10-。m01.幾、作用時(shí)間為24小時(shí)達(dá)峰,分別為陰性對(duì)照的2.27及1.91倍,具有顯著性差異。醛固酮作用5min及1小時(shí)不能使MDM2蛋白的表達(dá)顯著增加。醛固酮刺激可使HMCLs的S期細(xì)胞百分比增加,在醛固酮濃度為10-5M時(shí)達(dá)峰,為陰性對(duì)照的2.77倍,具有顯著性差異。針對(duì)MDM2不同DNA片段設(shè)計(jì)的siMDM2可使MDM2蛋白表達(dá)明顯下降、醛固酮+siMDM2刺激,不能使MDM2蛋白的表達(dá)明顯增加,相應(yīng)S期細(xì)胞百分比亦不升高。

9、螺內(nèi)酯可抑制醛固酮刺激導(dǎo)致的MDM2 mRNA及蛋白表達(dá)增加,與醛固酮刺激組(陽(yáng)性對(duì)照)比,螺內(nèi)酯的抑制率為44.44％。兩者間具顯著性差異,P值小于0.05。蛋白合成抑制劑放線菌酮可抑制醛固酮刺激導(dǎo)致的MDM2表達(dá)增加,與醛固酮刺激組(陽(yáng)性對(duì)照)比,兩者間具顯著性差異。在高醛固酮血癥及正常腎臟腎小球切片中,足細(xì)胞、系膜細(xì)胞MDM2染色均呈陽(yáng)性。高醛固酮血癥患者的腎小球中平均單位面積MDM2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照者明顯增多,兩組間差異有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。而兩者WT1平均單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目大致相仿(P=0.699)。
　　 結(jié)論:
　　 HMCs及HMCLs有MR、11β—HSD2表達(dá)。醛固酮刺激可導(dǎo)致HMCs及HMCLs MDM2表達(dá)增加,這種作用在一定范圍內(nèi)呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性。同時(shí)醛固酮可使HMCL細(xì)胞S期細(xì)胞百分比劑量依賴(lài)性地提高。針對(duì)MDM2不同DNA片段設(shè)計(jì)的siMDM2可抑制醛固酮刺激導(dǎo)致的S期細(xì)胞百分比增加,進(jìn)一步提示MDM2