三氟拉嗪對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、系膜細(xì)胞異常增殖將引起細(xì)胞外基質(zhì)的增多，導(dǎo)致腎小球硬化，多數(shù)患者甚至將不可逆的進(jìn)展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease,ESRD）。因此，抑制系膜細(xì)胞的過度增殖成為增生性腎小球疾病的治療靶點(diǎn)。本課題組從2010年開始研究了三氟拉嗪對(duì)人系膜細(xì)胞的體外作用效果及相關(guān)機(jī)制，同時(shí)觀察了三氟拉嗪（trifluoperazine，TFP）對(duì)狼瘡腎小鼠體內(nèi)系膜細(xì)胞的作用效果及機(jī)制，并進(jìn)一步研究了三氟拉嗪聯(lián)合環(huán)磷酰胺(cyclo

2、phosphamide，CTX)對(duì)系膜增生性疾病的治療效果。
　　第一部分：三氟拉嗪抑制體外和體內(nèi)系膜細(xì)胞的異常增殖
　　目的：
　　研究三氟拉嗪對(duì)體內(nèi)外系膜細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：
　?。?）體外實(shí)驗(yàn)采用MTT、臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖的情況。
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)HE、PAS、MASSON染色后觀察各組腎臟系膜細(xì)胞增生情況；免疫組化和Western Blotting方法檢測(cè)各組Ki67和

3、細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）的表達(dá)；采用ELISA方法檢測(cè)各組動(dòng)物血肌酐，尿素氮水平，比較各組小鼠腎功能的情況。
　　結(jié)果：
　　（1）體外實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，高濃度的血清即20％FBS組可以刺激系膜細(xì)胞的過度增殖，該效應(yīng)呈時(shí)間和劑量依賴性。TFP處理后，細(xì)胞增殖能力顯著下降，且該效應(yīng)呈劑量及時(shí)間依賴性；
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)HE，PAS和MASSON染色結(jié)果顯示，狼瘡性腎炎組（Lupus Nephritis，LN）小鼠較

4、正常組（Normal，N）有明顯的病理改變，實(shí)驗(yàn)組（LN+TFP）較 LN組系膜細(xì)胞增生程度減低。這一結(jié)果也在Ki67和PCNA的免疫組化及Western Blotting的研究中得到了驗(yàn)證。ELISA結(jié)果顯示，LN組血肌酐，尿素氮水平明顯高于Normal組，給藥TFP后兩組水平均降低。
　　結(jié)論：
　　三氟拉嗪可以抑制體內(nèi)外系膜細(xì)胞的異常增殖，并可以改善系膜增生性狼瘡腎小鼠的腎功能。
　　第二部分三氟拉嗪對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)

5、胞周期的影響及機(jī)制的研究
　　目的：
　　探討三氟拉嗪對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　（1）體外實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布，然后根據(jù)此流式分析結(jié)果，通過Western Blotting方法考察相關(guān)周期蛋白的變化。
　　（2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用Western Blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證TFP在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。免疫組化方法檢測(cè)CyclinD1在各組的表達(dá)情況。

6、　　結(jié)果：
　?。?）體外實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相較于正常系膜細(xì)胞組(N組)，20%FBS促進(jìn)了系膜細(xì)胞由G0/G1期逐漸向S期轉(zhuǎn)變，給藥后，G0/G1期的細(xì)胞百分比逐漸增加，相應(yīng)地S期的細(xì)胞漸減，該效應(yīng)具有劑量依賴性；Western Blotting結(jié)果證明，三氟拉嗪抑制CyclinD1，CDK2，CDK4蛋白的表達(dá)，促進(jìn)p21蛋白的表達(dá)，而對(duì)CyclinE，CDK6，p27蛋白表達(dá)影響不大。
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)West

7、ern Blotting結(jié)果與體外結(jié)果實(shí)驗(yàn)一致。進(jìn)一步，通過免疫組化結(jié)果可觀察到，狼瘡腎組（LN）CyclinD1表達(dá)較正常小鼠增高，給藥TFP后其表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　三氟拉嗪可以阻斷體外異常增殖的人系膜細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，這可能與它可以抑制CyclinD1，CDK2，CDK4蛋白的表達(dá)及促進(jìn)p21蛋白的表達(dá)相關(guān)。
　　第三部分：三氟拉嗪促進(jìn)系膜細(xì)胞的凋亡的研究
　　目的：

8、>　　探討三氟拉嗪對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)胞凋亡的的影響及機(jī)制
　　方法：
　?。?）體外實(shí)驗(yàn)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，Western Blotting，Real time PCR方法分析Bcl-2及BAX的表達(dá)變化。
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組情況同第一部分。分別采用Western Blotting和免疫組化方法檢查各組Bcl-2及BAX的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示

9、：與N組（Normal組）相比較，Con組(Control組，20%組)凋亡細(xì)胞比例明顯偏低。加三氟拉嗪干預(yù)24小時(shí)后，與Con組比較凋亡細(xì)胞比率明顯增加。Real time PCR結(jié)果顯示：與N相比較，Con組BAX mRNA的表達(dá)量較低，而Bcl-2 mRNA的表達(dá)量較高。三氟拉嗪給藥干預(yù)24小時(shí)后，我們可以看到與Con組比較，給藥組Con+TFP BAX mRNA的表達(dá)量顯著增高，而Bcl-2 mRNA的表達(dá)量顯著降低。Weste

10、rn Blotting所監(jiān)測(cè)蛋白水平的變化與基因水平變化相一致。
　?。?）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組化方法結(jié)果顯示：通過鏡下棕色顆粒的光密度分析，與N組（Normal組）小鼠相比較，LN組（狼瘡腎）BAX蛋白的表達(dá)量較高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)量也增加。三氟拉嗪灌胃給藥干預(yù)3個(gè)月后，BAX蛋白的表達(dá)量顯著升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低。進(jìn)一步比較三組BAX與Bcl-2的比值（BAX/Bcl-2 Ratio），可以看到LN組較N組

11、低。Western Blotting所監(jiān)測(cè)蛋白水平的變化與免疫組化結(jié)果相一致。
　　結(jié)論：
　　三氟拉嗪可以促進(jìn)系膜細(xì)胞的凋亡，是因?yàn)樗梢韵抡{(diào)Bcl-2水平的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)BAX的表達(dá)。
　　第四部分：三氟拉嗪通過P-JNK及p-AKT通路影響細(xì)胞的周期和凋亡
　　目的：
　　進(jìn)一步研究三氟拉嗪抑制系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制，以及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路P13K/AKT，MAPK/JNK和MAPK/ERK1/2的影響。<

12、br>　　方法：
　　采用Western Blotting方法分析TFP對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白p-AKT/AKT，p-ERK/ERK，p-JNK/JNK表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一 Western Blotting結(jié)果表明，與正常細(xì)胞對(duì)照組(Normal)相比，20%FBS組可以增加p-JNK，p-AKT，p-ERK蛋白的表達(dá)。給藥TFP后，p-JNK，p-AKT的表達(dá)下調(diào)，這種效應(yīng)具有劑量依賴性，而各種濃度的

13、TFP對(duì)p-ERK蛋白蛋白的表達(dá)均無影響。實(shí)驗(yàn)二 Western Blotting結(jié)果表明，與Normal組相比，PDGF刺激后可以增加p-JNK，p-AKT，p-ERK蛋白的表達(dá)。TFP20μM處理后， p-JNK，p-AKT的表達(dá)下調(diào)，但p-ERK蛋白的表達(dá)變化不明顯。
　　結(jié)論：
　　三氟拉嗪可能通過抑制JNK/MAPK及AKT/PI3K通路影響系膜細(xì)胞的周期和凋亡，而不影響ERK/MAPK通路。
　　第五部分：

14、三氟拉嗪聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療狼瘡性小鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　明確與使用單種藥相比，三氟拉嗪與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用可以更好地抑制狼瘡腎小鼠系膜細(xì)胞的增殖，以及觀察其對(duì)狼瘡腎小鼠肝、腎功能的影響。
　　方法：
　　HE、PAS染色后觀察各組腎臟系膜細(xì)胞增生情況；Western Blotting方法檢測(cè)各組Ki67和PCNA的表達(dá)；ELISA方法檢測(cè)各組動(dòng)物血肌酐，尿素氮，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，比較各組小鼠腎功能的情

15、況。
　　結(jié)果：
　　HE和PAS染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常小鼠組（N）小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；狼瘡腎組（LN）小鼠有明顯系膜細(xì)胞增生；狼瘡腎+三氟拉嗪組（LN+TFP）、狼瘡腎+環(huán)磷酰胺組（LN+CTX）較LN組細(xì)胞增生有所減輕；狼瘡腎+三氟拉嗪+環(huán)磷酰胺聯(lián)合減量用藥組（LN+1/2TFP+1/2CTX）與LN組相比，系膜細(xì)胞增生程度進(jìn)一步下降，該實(shí)驗(yàn)可從Ki67和PCNA的Western Blotting，免疫組化等結(jié)果進(jìn)一步佐

16、證。ELISA研究結(jié)果表明，LN組，LN+TFP組、LN+CTX組、LN+1/2TFP+1/2CTX較N組AST水平上升。與LN組相比，LN+TFP組，LN+1/2TFP+1/2CTX組AST水平無明顯差異，而 LN+CTX組顯著增高。研究還發(fā)現(xiàn)，LN+1/2TFP+1/2CTX組較LN+CTX組AST水平顯著降低。
　　結(jié)論：
　　三氟拉嗪與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用并且劑量減半，可以更好地抑制狼瘡腎小鼠系膜細(xì)胞的增殖并改善腎功能；