甲羥戊酸對人系膜細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、系膜增生性腎炎是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病之一，其主要病理表現(xiàn)為系膜細(xì)胞(MC)增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)聚集。MC是腎小球內(nèi)活躍的固有細(xì)胞，在腎小球損傷時(shí)，MC增生活躍而凋亡受阻，增生的MC能分泌轉(zhuǎn)化生長因子β<,1>(TGF-β<,1>)等多功能細(xì)胞因子，后者調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，刺激ECM[包括正常存在的膠原成分如Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)和間質(zhì)膠原如Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)]的合成，最終導(dǎo)致腎小球硬化，直至終末期。腎衰竭。因此抑制M

2、C增殖及ECM積聚一直受到廣泛關(guān)注，特別是關(guān)于細(xì)胞外各種有害刺激通過怎樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起MC的增殖及ECM分泌的機(jī)制是近年的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞的過度增殖往往伴有凋亡受阻，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。Bcl-2和：Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白.二者的比值決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，且與腎臟細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，羥甲基戊二酰輔酶A(H

3、MG-CoA)還原酶抑制劑抑制MC增殖的作用是通過阻斷細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸(MVA)代謝途徑而產(chǎn)生的非依賴于降血脂的多效性作用實(shí)現(xiàn)的，這些作用與細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等密切相關(guān)，并可能與絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。已知的MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括四個(gè)亞族，其中細(xì)胞外信號調(diào)控蛋白激酶(ERK)、c-JUN氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激激活的蛋白激酶(SAPK)和P38蛋白激酶(P38MAPK)介導(dǎo)了MC增殖與ECM分

4、泌，與系膜增生性腎炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MVA對MC的影響及其機(jī)制如何?MVA對MC ERK、JNK、P38MAPK通路及下游核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的影響如何?三條通路作用的相互關(guān)系如何?目前未見相關(guān)報(bào)道。 目的：觀察MVA對人類腎小球系膜細(xì)胞(HMC)增殖、ECM產(chǎn)生、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響，及其與TGF-β<,1>和MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，探討MVA對HMC的作用及其機(jī)制。 方法：1.HMC隨機(jī)分為8組，對照組及MV

5、A不同濃度組(1×10<'-9>mol/L、1×10<'-8>mol/L，1×10<'-7>mol/L、1×10<'-6>mol/L、1×10<'-6>mol/L、1×10<'-4>mol/L、1×10<'-3>mol/L)，應(yīng)用MTT法檢測活細(xì)胞數(shù)目及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。2.HMC隨機(jī)分為對照組和MVA組(MVA濃度根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)選擇1×10<'-7>mol/L)，各組分別取12、24、48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，應(yīng)用

6、MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測活細(xì)胞數(shù)目、PI及細(xì)胞凋亡；EIASA法檢測培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中TGF-β<,1>、Col-Ⅳ和Col-I的含量；Western blotting法檢測Bcl-2、Bax蛋白質(zhì)表達(dá)。3.HMC隨機(jī)分為8組，對照組、PD98059(ERK抑制劑)組、SP600125(JNK抑制劑)組、SB203580(P38抑制劑)組、MVA組、MVA+PD98059組、MVA+SP600125組、MVA+SB203580-組，于1

7、2 h收集細(xì)胞，觀察特異性的抑制各通路的激活后，前述指標(biāo)的變化。4.HMC隨機(jī)分為3大組，每大組分為4小組：A：對照組、SB203580組、MVA組、MVA+SB203580組；B：對照組、MVA組、SP600125組、MVA+SP600125組；C：對照組、PD98059組、MVA組、MVA+PD98059組，于12 h收集細(xì)胞，Westem blotting法檢測P-ERKl1/2、P-JNK、p-P38蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：

8、1.MVA在一定濃度范圍(1x10<'-9>-1×10<'-7>mol/L)和時(shí)間(12-48 h)內(nèi)可促進(jìn)體外培養(yǎng)的HMC增殖并促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，以1×10<'-7>mol/L作用最明顯；2.1×10<'-7>mol/L的MVA可誘導(dǎo)HMC增殖；PI升高；TGF-β<,1>表達(dá)增加；Col-Ⅳ和Col-Ⅰ產(chǎn)牛增加；細(xì)胞凋亡減少；Bcl-2/Bax比值增加；3.MVA可使磷酸化的ERK和JNK表達(dá)明顯增加，ERK特異性抑制劑PD9805