甲羥戊酸激酶突變導(dǎo)致光敏性汗孔角化癥的致病機制研究.pdf

1、目的:甲羥戊酸激酶(MVK)可將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸。前期研究中在多個光敏性汗孔角化癥（DSAP）家系及散發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)MVK基因突變，但是其具體的致病機制不明。本研究擬探討MVK相關(guān)突變導(dǎo)致DSAP的機制，加深對這一疾病的認識。
　　方法:采集正常人和患者外周血，抽提淋巴細胞總RNA， real timePCR和RT-PCR研究mRNA表達水平。構(gòu)建相關(guān)真核表達載體，在HEK293中表達MVK野生型和DSAP相關(guān)突變，

2、免疫印跡觀察蛋白表達。建立MVK野生型和DSAP相關(guān)突變的HEK293穩(wěn)定表達細胞系，使用放線菌酮(Chcloheximide CHX)抑制蛋白合成，在不同時間點收集蛋白，免疫印跡檢測MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型的半衰期。使用蛋白酶體抑制劑(MG132)，溶酶體抑制劑(CQ)阻斷MVK的降解，免疫印跡觀察MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型的降解途徑。在HEK293細胞中瞬時表達GFP標簽或FLAG標簽的MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型

3、，對過氧化物酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的標志蛋白進行免疫熒光染色，研究MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型進行亞細胞定位。構(gòu)建pGEX-4T-2骨架的MVK野生型及DSAP相關(guān)突變質(zhì)粒，在BL21感受態(tài)中通過IPTG誘導(dǎo)原核表達GST融合蛋白，GST pull down研究MVK野生型和DSAP相關(guān)突變形成同源二聚體的能力。在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)GFP標簽和FLAG標簽的MVK野生型和/或DSAP相關(guān)突變型，免疫共沉淀研究MVK野生型和

4、DSAP相關(guān)突變型形成同源二聚體的能力。
　　結(jié)果:
　　1.A189V突變患者mRNA表達低于正常人;DSAP相關(guān)突變蛋白表達低于野生型;
　　2.DSAP相關(guān)突變蛋白的降解較野生型蛋白明顯加快;DSAP野生型和相關(guān)相關(guān)突變蛋白主要通過蛋白酶體途徑降解;
　　3.MVK野生型和DSAP相關(guān)突變型為細胞質(zhì)分布;MVK野生型和DSAP相關(guān)突變與過氧化物酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沒有共定位;
　　4.MVK野生型和A