無義突變導致SMN1基因mRNA降解的致病機制研究.pdf

1、近端脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是嬰幼兒較常見的致死性常染色體隱性遺傳病。致病基因為位于5q11.2-13區(qū)域的運動神經元存活基因1(survival motor neuron1，SMN1)，該基因的純合缺失或復合雜合突變都會導致疾病的發(fā)生。約90％的SMA患兒存在SMN1基因的純合缺失，5％～10％的患兒存在SMN1基因的復合雜合突變（即一個SMN1基因缺失，另一個SMN1基因發(fā)生了點突變）

2、。SMN1基因內的小突變的致病機制至今尚未完全明確。本實驗室報道的突變p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*分別導致在外顯子2和外顯子5出現(xiàn)了提前終止密碼子(prematuretranslational-termination codon，PTC)，前期研究發(fā)現(xiàn)，在外周血中，攜帶突變的患兒的SMN1 mRNA水平顯著下降。我們由此猜想，導致SMN1基因mRNA降解的突變可能是因為位于引發(fā)NMD機制(nonsense-medi

3、atedmRNA decay，NMD)的位置，通過NMD途徑介導了含有提前終止密碼子的mRNA的降解，導致患兒疾病表型。NMD介導的SMN1轉錄本異?？赡苁荢MA的致病機制之一，抑制NMD介導的mRNA降解，上調SMN蛋白表達可能將是一個靶向RNA的SMA治療方向。
　　目的：本研究以影響SMN1 mRNA降解的突變?yōu)檠芯堪悬c，建立SMA病人淋巴細胞系和成纖維細胞系模型，通過翻譯抑制實驗，探討無義突變導致SMN1基因mRNA降解的

4、致病機制。
　　對象及方法：
　　1.研究對象
　　2例攜帶致SMN1 mRNA降解的突變的SMA患兒作為病例組。3例SMN1純合缺失患者，5例SMN1單拷貝攜帶者及3例SMN1兩拷貝的正常兒童作為對照組。取肝素抗凝血建立淋巴細胞系，取皮膚組織建立成纖維細胞系，準備后續(xù)研究。
　　2.研究方法
　　建立攜帶無義突變p.Leu228*和移碼突變p.Val19Glyfs*21的患兒的永生淋巴細胞系和皮膚成纖維細

5、胞系。檢測細胞系中SMN1全長轉錄本和全長SMN蛋白水平，檢測突變對轉錄水平和蛋白水平的影響。應用翻譯抑制劑（嘌呤霉素和放線菌酮）分別處理病人及對照樣本的淋巴細胞系和成纖維細胞系，比較處理前后fl-SMN1和SC351.7kb的mRNA轉錄水平。通過上述分析，確定突變是否是通過NMD機制介導SMN1轉錄和SMN蛋白表達下調。
　　結果：
　　1、突變p.Val19Glyfs*21在成纖維細胞系中SMN1 RNA水平為正常對照

6、的24％(p=0.003)，淋巴細胞系中為正常對照的15％(p=0.004)。突變p.Leu228*在淋巴細胞系中SMN1 RNA水平為正常對照的5.2％(p=0.002)。兩種突變的SMN1轉錄水平明顯降低。突變p.Val19Glyfs*21的SMN蛋白表達量低于正常人，稍高于純合缺失患者。
　　2、應用不同濃度嘌呤霉素（100ug/ml、200ug/ml和400ug/ml）和不同濃度放線菌酮（50ug/ml、100ug/ml和

7、150ug/ml）分別作用5.5h、10h，病例組干預后fl-SMN1 mRNA水平均有顯著提高，對照組干預前后fl-SMN1mRNA水平無統(tǒng)計學差異。
　　3、在不同突變和不同細胞系中，嘌呤霉素作用均表現(xiàn)時間依賴和劑量依賴，放線菌酮作用只表現(xiàn)時間依賴，不表現(xiàn)劑量依賴。不同突變對藥物反應的敏感性不同。
　　4、攜帶相同突變（p.Va119Glyfs*21）的不同細胞系（成纖維細胞系、淋巴細胞系）對相同藥物反應的敏感性不同。N