不同肢端畸形中基因突變鑒定及致病機(jī)制研究.pdf

1、先天性肢端畸形是人類最常見的出生缺陷之一，不僅影響肢體的外觀形態(tài)和功能運(yùn)動，甚至使患者喪失勞動和生活能力。近年來，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類單基因遺傳病致病基因鑒定不斷取得進(jìn)展，各種四肢先天畸形的致病基因也逐漸被發(fā)現(xiàn)，人類先天性肢端畸形研究的數(shù)據(jù)不僅將補(bǔ)充以往動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的不足，還可以加深對胚胎發(fā)育過程的理解，而且可以為人類組織工程學(xué)研究和基因治療藥物的研制提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)，因此對肢端畸形的致病基因突變鑒定及致病機(jī)制研究至關(guān)重

2、要。 引起先天性肢端畸形的原因有環(huán)境因素和遺傳因素兩大類。遺傳因素主要指基因突變或染色體畸變，其導(dǎo)致的肢端畸形既可單獨(dú)發(fā)生又可是某種綜合征的一部分。多種基因突變和染色體畸變都會直接引起肢端形態(tài)發(fā)生(morphogenesis)的異常，表現(xiàn)不同類型的肢端畸形，如短指(趾)(brachydactyly，BD)、缺指(趾)(ectrodactyly，ED)、多指(趾)(polydactyly，PD)和并指(趾)(syndactyly，

3、SD)畸形等。 本文以上述肢端畸形的三個(gè)中國人家系(SYM1、SHFM和HFGS)為研究對象，首先利用單體型分析進(jìn)行了致病基因染色體定位，然后對候選基因DNA測序或定量PCR進(jìn)行突變鑒定，進(jìn)一步通過western blot、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)對突變基因功能進(jìn)行初步研究。 材料與方法： 1、家系資料 對家系中可能追溯到的家庭成員進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，繪制家系系譜圖；簽署“知情同意書”；

4、對患者進(jìn)行體格檢查和手足骨骼X光檢查；采集外周靜脈血。 2、單體型分析定位候選致病基因 利用UCSC基因組生物信息學(xué)網(wǎng)站在5個(gè)SHFM位點(diǎn)選擇20對微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記，PCR擴(kuò)增后經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，讀出每個(gè)個(gè)體標(biāo)記的基因型。再根據(jù)個(gè)體基因型和系譜中的親緣關(guān)系，按照孟德爾遺傳定律推導(dǎo)出同一條染色體上不同標(biāo)記構(gòu)成的單體型。 3、候選基因編碼區(qū)DNA測序 根據(jù)單體型分析確定候選基因后，PCR擴(kuò)增患者候

5、選基因外顯子，PCR產(chǎn)物純化后測序。 4、定量PCR檢測基因組拷貝數(shù)變異 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增患者候選基因，與正常個(gè)體比較其基因組拷貝數(shù)是否發(fā)生改變。 5、長距離PCR結(jié)合DNA測序確定斷裂點(diǎn) 定量PCR將兩側(cè)斷裂點(diǎn)范圍縮小到2—4kb后，以患者基因組DNA為模板，利用端粒側(cè)重復(fù)的正向引物R2—2F及中心粒側(cè)重復(fù)的反向引物L(fēng)10-5R(outfacing primers)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化

6、后測序。 6、構(gòu)建野生型和突變型真核表達(dá)載體 PCR擴(kuò)增目的基因GDF5和HOXA13編碼序列，分別與真核表達(dá)載體pLXSN和p3xFLAG—CMV7連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆測序驗(yàn)證；以野生型載體為模板，定點(diǎn)誘變產(chǎn)生突變型載體。 7、Western blot檢測GDF5L373R二聚體形成和分泌 G418篩選穩(wěn)定整合野生型和突變型GDF5的COS7細(xì)胞系，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞總蛋白，經(jīng)非還原S

7、DS-PAGE電泳后檢測GDF5L373R二聚體形成和分泌情況。 8、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測HOXA13V375F對EphA7基因的轉(zhuǎn)錄激活能力 將野生型和突變型HOXA13真核表達(dá)載體分別與報(bào)告基因pGL3—EphA7及內(nèi)參基因pRL—CMV共轉(zhuǎn)染C3H10 T1/2細(xì)胞，計(jì)算螢光素酶比活性。 9、染色質(zhì)免疫共沉淀檢測HOXA13V375F對下游靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合能力 將野生型和突變型HOXA

8、13真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染C3H10 T1/2細(xì)胞，利用anti—Flag單克隆抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，然后利用定量PCR檢測免疫沉淀的DNA量是否有變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、家系資料 根據(jù)患者的肢端畸形特征及臨床表現(xiàn)和X光片等將收集的3個(gè)家系分別診斷為SYM1、SHFM和HFGS。 2、單體型分析 染色體20q11區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記D20S787、D20S601、D20S909和D20S914與SYM

9、1家系畸形共分離：染色體10q24區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記LBXIT1、D10S1239、DactylinTAAT、Dactylin2和Dactylin3與SHFM家系畸形共分離。 3、候選基因編碼區(qū)DNA測序 SYM1家系患者檢測到GDF5基因雜合錯(cuò)義突變c．1118T>G(p.L373R)；HFGS家系患者檢測到HOXA13基因雜合錯(cuò)義突變c．1123G>T(p.V375F)。突變直接導(dǎo)致限制性片段長度多態(tài)性(restri

10、ction fragment length polymorphism，RFLP)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證，家系的患者都攜帶突變，而家系的正常個(gè)體和50名正常無關(guān)對照個(gè)體都不攜帶此突變。 4、定量PCR檢測基因組拷貝數(shù)變異 定量PCR結(jié)果表明SHFM家系患者在染色體10q24區(qū)域存在包括LBX1、BTRC、POLL、DPCD和FBXW4等五個(gè)基因在內(nèi)的重復(fù)突變，DNA增加一個(gè)拷貝。 5、長距離PCR結(jié)合DNA測序確

11、定重排斷裂點(diǎn) 利用正向引物R2—2F和反向引物L(fēng)10-5R行PCR擴(kuò)增，SHFM家系患者的基因組都可以擴(kuò)出約2000bp的特異性片段，而家系的正常個(gè)體擴(kuò)增不出此片段，測序結(jié)果表明端粒側(cè)和中心粒側(cè)的斷裂點(diǎn)分別在103453895bp處和102965035bp處，重復(fù)范圍為488859bp，重復(fù)方式為串聯(lián)重復(fù)。根據(jù)斷裂點(diǎn)堿基信息，推測其重復(fù)機(jī)制可能為非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或復(fù)制

12、叉停滯和模板轉(zhuǎn)換(replication fork stalling and template switching，F(xiàn)oSTeS)。 6、構(gòu)建野生型和突變型真核表達(dá)載體 測序結(jié)果表明野生型和突變型GDF5真核表達(dá)載體(pLmycGDF5WTSN和pLmycGDF5L373RSN)和HOXA13真核表達(dá)載體(p3xFLAG—HOXA13及p3xFLAG—HOXA13V375F)構(gòu)建成功，無突變，閱讀框正確。 7、W

13、estern blot檢測GDF5L373R二聚體形成和分泌 Western blot檢測結(jié)果表明GDF5L373R突變體可以二聚化并分泌至細(xì)胞外。 8、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測HOXA13V375F對EphA7基因的轉(zhuǎn)錄激活能力 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明突變型HOXA13V375F轉(zhuǎn)錄激活EphA7基因的能力下降至野生型的66.72％。 9、染色質(zhì)免疫共沉淀檢測HOXA13V375F對下游

14、靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合能力 定量PCR檢測染色質(zhì)免疫沉淀下游靶基因DNA量，結(jié)果表明與HOXA13V375F突變體結(jié)合的EphA7、EphA6和Bmp2啟動子及Sostdcl3'UTR的量分別降低至野生型的65.98％、72.95％、42.89％和68.03％；與HOXA13V375F突變體結(jié)合的Bmp7和Sostdcl啟動子的量與野生型比較無明顯差異。 結(jié)論： (1) SYM1家系致病基因突變?yōu)镚DF5基因雜合錯(cuò)

15、義突變c．1118T>G(p.L373R)。GDF5L373R突變體可以二聚化并分泌至細(xì)胞外。 (2) SHFM家系致病基因突變?yōu)槿旧w10q24區(qū)域包括LBX1、BTRC、POLL。DPCD和FBXW4等五個(gè)基因在內(nèi)的488859bp串聯(lián)重復(fù)突變。 (3) HFGS家系致病基因突變?yōu)镠OXA13基因雜合錯(cuò)義突變c．1123G>T(p.V375F)。HOXA13V375F突變體對EphA7轉(zhuǎn)錄激活能力下降，對EphA7、