DOC-1R負(fù)性調(diào)節(jié)DNA復(fù)制及并多指(趾)畸形家系致病基因突變研究.pdf

1、前言：
　　在真核生物細(xì)胞周期的各個事件中，DNA復(fù)制過程是一個被嚴(yán)格調(diào)控的事件，受到G1/S限制點(diǎn)的檢查，與細(xì)胞周期其他事件協(xié)調(diào)發(fā)生。DNA復(fù)制的紊亂將直接導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。DNA聚合酶alpha-引物酶復(fù)合物（DNA polymerase alpha-primase，pol-prim）是負(fù)責(zé)DNA復(fù)制起始的聚合酶。該酶由四個亞基組成，其中p180有聚合酶活性，p70調(diào)控pol-prim活性，p180

2、在整個細(xì)胞周期中均處于磷酸化狀態(tài)，p70以細(xì)胞周期依賴性方式被磷酸化，從而活化pol-prim。周期素(cyclin)E/細(xì)胞周期依賴性激酶2(cell cycle dependent kinase2，CDK2)在S期復(fù)制起始階段磷酸化p70，激活pol-prim。
　　口腔癌缺失基因-1相關(guān)基因（deleted in oral cancer-1-related，DOC-1R）是張學(xué)教授等發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因。RT-PCR結(jié)果表明，

3、DOC-1R在所檢測的小鼠各組織中普遍表達(dá)，在卵母細(xì)胞中也有表達(dá)，提示DOC-1R可能是哺乳動物的管家基因。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，DOC-1R轉(zhuǎn)基因表達(dá)明顯地抑制了細(xì)胞體外集落形成能力，提示DOC-1R對細(xì)胞增殖有抑制作用。細(xì)胞生長曲線和5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2deoxyuridine，BrdU）摻入實(shí)驗(yàn)表明，DOC-1R轉(zhuǎn)基因表達(dá)能夠抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長，并明顯抑制其DNA復(fù)制過程。
　　Wong等研究表明

4、DOC-1R的同源蛋白，口腔癌缺失基因-1（deleted in oralcancer-1，DOC-1），能夠分別和pol-prim及CDK2結(jié)合，通過抑制CDK2/cylin E對p70的磷酸化，從而抑制DNA復(fù)制起始。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)在與CDK2及pol-prim兩蛋白結(jié)合區(qū)域，DOC-1蛋白和DOC-1R蛋白的相應(yīng)區(qū)域高度同源。因此，我們推測DOC-1R蛋白可能也結(jié)合CDK2和pol-prim，并抑制兩者活性從而抑制DNA復(fù)制起

5、始。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以上假設(shè)展開DOC-1R負(fù)性調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的機(jī)理研究。
　　材料與方法：
　　1、pLXSN-FLAG-1R及pLXSN-FLAG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
　　兩端帶有EcoR I/BamH I酶切位點(diǎn)的FLAG-DOC-1R以及FLAG插入片段分別通過PCR擴(kuò)增和人工合成獲得。用EcoR I/BamH I雙酶切消化pLXSN載體及插入片段。連接酶切后的載體和插入片段，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)

6、切酶酶切鑒定得到候選陽性克隆，測序以證實(shí)構(gòu)建成功。
　　2、流式細(xì)胞分析儀檢測DOC-1R對細(xì)胞周期的影響
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-FLAG-DOC-1R以及pVSV-G，以LipofeetamineTM2000共轉(zhuǎn)染GP-293細(xì)胞，在GP-293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h后，過濾細(xì)胞培養(yǎng)液上清，以收集病毒。HeLa細(xì)胞感染病毒48 h后，應(yīng)用PI染料通過流式細(xì)胞分析儀檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞周期時相分布，記錄

7、位于各期的細(xì)胞百分率。三次結(jié)果取平均值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞周期分布差異。
　　3、免疫沉淀方法分析DOC-1R與CDK2蛋白的相互作用
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細(xì)胞后48 h裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液中加入FLAG抗體，4℃搖動過夜。次日加入30μl protein G Beads混合3h，洗脫液洗Beads5次，后離心沉淀Beads。Western印跡檢測共沉淀的CDK2蛋白。
　　4、DOC-1R對細(xì)

8、胞內(nèi)CDK2蛋白激酶活性的影響
　　以CDK2抗體經(jīng)免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)從DOC-1R病毒感染細(xì)胞裂解液和對照組中純化CDK2蛋白，150μg總蛋白中純化的CDK2蛋白溶解于15μl激酶反應(yīng)緩沖液中，加入ATP與底物histone H1在30℃孵育90 min，加入激酶活性檢測試劑Kinase GloTM室溫孵育10 min后，發(fā)光儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定DOC-1R表達(dá)對CDK2活性

9、的影響。
　　5、免疫沉淀方法分析DOC-1R與pol-prim p180的相互作用
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細(xì)胞后48 h裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液中加入FLAG抗體，4℃搖動過夜。次日加入30μl protein G Beads混合3h，洗脫液洗Beads5次，后離心沉淀Beads。Western印跡檢測共沉淀的pol-prim p180。
　　6、DOC-1R對pol-prim活性的影響
　　以p70抗體經(jīng)免疫

10、沉淀從DOC-1R病毒感染組細(xì)胞裂解液和對照組細(xì)胞裂解液中純化p70蛋白后，以Western印跡分別檢測磷酸化的p70及p70總蛋白。Western印跡結(jié)果經(jīng)灰度值掃描后，以磷酸化p70灰度值相對p70總蛋白灰度值的比值phospho-p70/p70/p70代表相對磷酸化程度，p70的磷酸化程度高則反應(yīng)pol-prim活性強(qiáng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、pLXSN-FLAG-DOC-1R和pLXSN-FLAG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)

11、建
　　以菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定得到候選陽性克隆，測序結(jié)果表明所得到的克隆序列及開放閱讀框架完全正確。
　　2、流式細(xì)胞分析儀檢測DOC-1R對細(xì)胞周期的影響
　　(1)與對照組相比，感染DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，G1期細(xì)胞比率增加，S期細(xì)胞比率減少。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　(2)M期細(xì)胞比率在實(shí)驗(yàn)組與對照組間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、免疫沉淀證實(shí)

12、DOC-1R與CDK2在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合
　　以DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細(xì)胞，以pLXSN-FLAG產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染對照組HeLa細(xì)胞。以抗-FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，CDK2抗體進(jìn)行Western印跡分析。實(shí)驗(yàn)組檢測到CDK2，而對照組未檢測到CDK2蛋白。證明DOC-1R與CDK2在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。
　　4、體外激酶活性檢測表明DOC-1R下調(diào)CDK2的激酶活性
　　感染DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞中，相對熒光

13、單位(relative light unit，RLU)為17731，感染對照逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞的RLU為12283，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，此差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性，P＜0.01。
　　5、免疫沉淀證實(shí)DOC-1R與pol-prim p180在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合
　　以DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細(xì)胞，以pLXSN-FLAG產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染對照組HeLa細(xì)胞。以抗-FLAG抗體進(jìn)行IP，pol-prim p180抗體進(jìn)行Western

14、印跡分析。實(shí)驗(yàn)組檢測到pol-prim p180，而對照組未檢測到pol-prim p180蛋白。證明DOC-1R與pol-prim p180在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。
　　6、DOC-1R對pol-prim活性的影響
　　感染DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞中，phospho-p70/p70比值為0.242;感染對照逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞的phospho-p70/p70比值為0.735。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，此差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性，P＜0.01。DO