一個中國B1型短指家系致病基因突變檢測及初步功能研究.pdf

1、目的：
　　B型短指(Brachydactyly type B，BDB)是一種以遠端指（趾）骨發(fā)育不良為主要特征的常染色體顯性遺傳疾病。它分為兩個亞型: Brachydactyly type B1(BDB1，MIM113000)由位于9q22的ROR2基因突變引起;Brachydactyly typeB2(BDB2，MIM611377)由骨形成拮抗物NOGGIN突變導(dǎo)致。迄今為止導(dǎo)致BDB1的ROR2基因突變主要是無義突變及移碼突

2、變，主要集中在ROR2基因的第8、9外顯子上，均產(chǎn)生截短蛋白。本研究擬通過對一個中國BDB1家系進行致病基因ROR2突變鑒定，明確其突變類型，并通過免疫共沉淀研究野生型及該突變型ROR2與14-3-3β相互作用情況，初步了解野生及突變型ROR2蛋白功能。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　1、一個中國BDB1家系全體成員及82例無親屬關(guān)系正常對照的外周靜脈血。
　　2、PCR及基因檢測相關(guān)試劑及試劑盒。
　

3、　3、RT試劑盒。
　　4、免疫共沉淀及Western blot相關(guān)試劑。
　　二、實驗方法
　　1、家系資料
　　繪制一個中國短指家系系譜圖，簽署“知情同意書”，對患者進行體格檢查和手足骨骼X光檢查，采集該家系5例患者、6例正常親屬及82例無親屬關(guān)系正常對照外周血，并收集臨床資料。
　　2、DNA測序
　　PCR擴增目的基因，PCR產(chǎn)物純化后在ABI3730測序儀上檢測分析。
　　3、構(gòu)建野生

4、型、突變型ROR2和14-3-3β的表達載體
　　PCR擴增目的基因ROR2和14-3-3β的編碼序列，并分別克隆到表達載體pCMV-myc及pCMV-HA上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆測序驗證;隨后以野生型重組質(zhì)粒pCMV-myc-ROR2為模板定點誘變產(chǎn)生突變型pCMV-myc-ROR2載體，并測序分析驗證。
　　4、免疫共沉淀檢測野生型及突變型ROR2與14-3-3β的相互作用情況
　　培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，采用脂

5、質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pCMV-HA-14-3-3β分別與pCMV-myc、野生型pCMV-myc-ROR2及突變型pCMV-myc-ROR2共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24或48h后裂解細(xì)胞提取上清，將上清與c-myc抗體及瓊脂糖珠子孵育，洗脫，用western blot技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物，電化學(xué)發(fā)光法分析，鑒定結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1、該家系患者2-5指遠節(jié)指骨不同程度發(fā)育不全或短小，足趾輕度發(fā)育不全。X線顯示

6、先證者雙手2-5中遠節(jié)指骨融合或缺如，伴有第4掌骨細(xì)短;Ⅱ-2顯示左手2-5指中遠節(jié)指骨融合，右手第2、4、5指中遠節(jié)指骨融合;余兩個患者（Ⅱ-5和Ⅲ-1）顯示雙手2-5指中遠節(jié)指骨融合，其中Ⅲ-1伴有第4、5掌骨細(xì)短。所有患者均有雙足2-5趾中遠節(jié)趾骨融合。據(jù)以上臨床特征及X線結(jié)果可診斷為BDB1。
　　2、我們在ROR2基因第9外顯子上檢測到一個新的雜合缺失突變c.1396-1398delAA，所有家系患者攜帶此突變，家系正常

7、個體及82名無關(guān)對照個體不攜帶此突變。該突變導(dǎo)致ROR2基因編碼的氨基酸在466位發(fā)生移碼改變，產(chǎn)生一段包含57個氨基酸的新肽鏈，并在氨基酸第523位提前終止合成蛋白。同時，我們還發(fā)現(xiàn)兩個單核苷酸多態(tài)c.2088C＞T和c.2455G＞A。
　　3、經(jīng)測序鑒定結(jié)果表明pCMV-HA-14-3-3β、野生型pCMV-myc-ROR2及突變型pCMV-myc-ROR2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　4、通過免疫共沉淀技術(shù)未能檢測出野生型