一個中國漢族早老癥家系致病基因的確定和RNA-Seq分析.pdf

1、本文對一個中國漢族早老癥家系致病基因的確定和RNA-Seq進行了分析。本研究分為三個部分：
　　第一章：早老癥患者臨床特征分析及致病基因檢測。
　　目的：通過收集早老癥家系中患兒的臨床資料及血液檢測指標，分析早老癥患兒的臨床特征；通過對早老癥家系中3名患兒及其親屬進行遺傳分析和基因檢測，明確早老癥家系中患兒致病基因。
　　方法：收集早老癥家系3名患兒及其父母的臨床資料及影像學資料。同時獲取3名患兒及其父母外周血，一部分

2、進行血常規(guī)、血生化、自身抗體等檢測；一部分進行染色體G-顯帶分析。家系全部成員收集外周血進行LMNA基因外顯子測序分析。
　　結果：家系中3名患兒均表現出典型的早老表型，同時3名患兒血脂、堿性磷酸酶、血清磷、血小板均升高；影像學上見小下頜、梨形胸、鎖骨
　　缺失、脊柱畸形等；染色體G帶未見異常，這些均符合早老癥患兒特征。LMNA基因外顯子測序結果發(fā)現家系中患者父母為9號外顯子R527C雜合突變，而家系中3名患兒為R527C純

3、合突變。
　　結論：根據臨床特征結合基因檢測結果診斷該家系所患疾病為兒童早老癥；確定該早老癥家系為LMNA基因R527C純合突變所致。
　　第二章：早老癥患者外周血白細胞RNA-seq分析。
　　目的：通過RNA-Seq技術分析早老癥患兒差異表達基因，分析其致病的分子機制。
　　方法：獲取家系中3名早老癥患兒外周血，分離白細胞作為病例組；獲取4名健康同齡兒童外周血，分離白細胞后將4名健康兒童白細胞混在一起作為一個

4、正常對照組。病例組和對照組白細胞一起寄送深圳華大基因公司進行RNA提取及RNA-Seq分析。
　　結果：樣本RNA質量及RNA-seq測序結果均合格。通過轉錄組測序發(fā)現3名早老癥患兒（按照年齡從小到大排列）與健康對照組比較分別有712，1175，1215個基因差異表達（p＜0.05）。對差異表達基因進行GO分析和KEGG通路分析發(fā)現有絲分裂過程及風濕通路、細胞周期通路等相關基因表達差異顯著。
　　結論：RNA-Seq分析獲得

5、的早老癥差異表達基因與文獻報道的基因芯片分析結果一致；RNA-seq分析發(fā)現早老癥患兒存在細胞周期調控基因及風濕通路激活相關基因的表達量改變。
　　第三章：早老癥患者差異表達基因的qPCR驗證和免疫組織化學分析。
　　目的：通過qPCR及免疫組織化學方法檢測早老癥患兒差異基因表達情況。
　　方法：獲取3名早老癥患兒及11名健康同齡兒童的外周血，提取RNA，利用qPCR方法驗證風濕通路基因CD80、FOS、IL8、CXC

6、L1高表達。獲取早老癥家系先證者及5名系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者、12名系統(tǒng)性硬皮病患者、9名局限性硬皮病患者皮損組織切片及8名健康體檢者皮膚組織切片，運用免疫組織化學方法檢測不同組皮膚中FOS的表達情況。
　　結果：qPCR結果發(fā)現早老癥患兒外周血白細胞CD80、FOS、IL8、CXCL1表達量均較健康同齡兒童高，與RNA-Seq結果一致，除CD80外，其余三個基因表達差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。免疫組織化學結果發(fā)現早老癥患兒皮損