短肢畸形致病基因篩查方法建立和產(chǎn)前診斷應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　出生缺陷在我國(guó)每年的發(fā)生率高達(dá)4-6％。胎兒骨骼發(fā)育異常是常見的出生缺陷之一，其致病機(jī)制，涉及400多個(gè)致病基因突變，分布于細(xì)胞外基質(zhì)、已知的信號(hào)通路、細(xì)胞骨架成分、鈣-磷代謝、轉(zhuǎn)錄因子、脂類合成、破骨細(xì)胞相關(guān)基因、溶酶體水解酶等，導(dǎo)致456種骨病發(fā)生。其中80余種基因突變與生長(zhǎng)板發(fā)育相關(guān)，引起長(zhǎng)骨發(fā)育異常造成短肢畸形。目前臨床上依賴B超檢查在孕晚期可以發(fā)現(xiàn)部分的胎兒骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常，但超聲診斷無法明確疾病類型，故對(duì)相

2、關(guān)致病基因的檢測(cè)意義重大。某些短肢畸形，在胎兒時(shí)期并無臨床癥狀，孕期產(chǎn)前超聲檢查并未發(fā)現(xiàn)異常，出生2-3年后才出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，并逐漸加重，如假性軟骨發(fā)育不全，故對(duì)先證者基因篩查用于下一胎產(chǎn)前診斷成了唯一診斷途徑。如何快速、便宜、敏感、準(zhǔn)確地對(duì)短肢畸形先證者或超聲檢查提示異常的胎兒進(jìn)行致病基因篩查是目前研究難題，熱點(diǎn)突變篩查是常用策略，如短肢畸形中，軟骨發(fā)育不全與FGF信號(hào)通路相關(guān)，F(xiàn)GF受體FGFR3基因G1138A的熱點(diǎn)突變成為98％軟

3、骨發(fā)育不全的致病原因，故為短肢畸形的首選分子檢測(cè)靶標(biāo);低磷酸酶血癥與堿性磷酸酶基因ALPL突變相關(guān)，突變達(dá)250多種，熱點(diǎn)突變集中在5-6和9-12外顯子區(qū)域。但重癥低磷酸酶血癥與ALPL基因多點(diǎn)突變關(guān)聯(lián)，熱點(diǎn)突變檢測(cè)可能導(dǎo)致重癥患者誤診，全基因掃描更適合臨床;COL1A1、COL1A2是成骨不全的致病基因，大小分別為50kb和60kb，并由50和52個(gè)外顯子組成，分子診斷較困難;大部分短肢畸形臨床無法明確分型，致病基因聯(lián)合檢測(cè)是提供臨

4、床診斷的重要依據(jù)。
　　目的：本研究采用Sanger測(cè)序法、靶基因捕獲高通量測(cè)序方法，針對(duì)本中心收集的短肢畸形先證者或胎兒進(jìn)行致病基因熱點(diǎn)突變篩查或全基因組靶基因篩查，分析突變位點(diǎn)與臨床表型關(guān)聯(lián)性，對(duì)未明確位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，獲得致病性依據(jù);初步了解本區(qū)域短肢畸形發(fā)生的致病基因譜，目的是建立適合臨床應(yīng)用的靶基因全序列檢測(cè)方案，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。
　　方法：收集2012年9月至2014年12月間來我院進(jìn)行遺傳和

5、產(chǎn)前咨詢的患者。根據(jù)臨床咨詢、臨床表型、X光檢測(cè)、B超檢查診斷為短肢畸形患者31例，均為散發(fā)病例。其中8例為先證者，男性患者5例，平均年齡16.4歲，女性患者3例，平均年齡20歲，其中2例為孕婦，為遺傳咨詢，尋求產(chǎn)前診斷前來就診;其余23例為胎兒，孕婦孕周在16-33周，平均年齡為32歲，因超聲診斷短肢畸形要求產(chǎn)前診斷。本研究首先采用熱點(diǎn)突變篩查方法，合成FGFR3基因G380R、R248C位點(diǎn)引物，PCR擴(kuò)增，Sanger測(cè)序篩查特異

6、突變位點(diǎn);然后根據(jù)臨床表型，合成ALPL基因12個(gè)編碼外顯子及兩側(cè)內(nèi)含子引物，PCR擴(kuò)增，Sanger測(cè)序法逐一明確ALPL基因的雙點(diǎn)突變位置;對(duì)疑似成骨不全患者或臨床無法確診的8個(gè)病例，利用NimbleGen芯片固相捕獲COL1A1、COL1A2、CRTAP、LC26A2、COMP、COL9A1、COL9A2、COL9A3、ATN、 FGFR2、FGFR3、SLC35D1、IDS、IDUA基因，illumina Hiseq2000測(cè)序

7、，獲取數(shù)據(jù)分析比對(duì)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)靶基因突變位點(diǎn)，并嘗試對(duì)發(fā)現(xiàn)的MATN3基因突變位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞水平功能驗(yàn)證。篩查到的已知致病位點(diǎn)均擴(kuò)大父母檢測(cè)，以明確遺傳方式，為下一胎產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。
　　結(jié)果：1、31例短肢畸形患者用熱點(diǎn)突變檢測(cè)出FGFR3基因G380R位點(diǎn)錯(cuò)義突變7例(22.6％)，R248C位點(diǎn)錯(cuò)義突變2例(6.4％)。用單基因Sanger測(cè)序法逐一外顯子測(cè)序檢測(cè)出ALPL基因R136H、V382I位點(diǎn)純合突變1例(3.2％)

8、。利用靶基因芯片捕獲高通量測(cè)序檢測(cè)出IDS基因R468Q位點(diǎn)突變1例(3.2％);COL1A2基因P857T位點(diǎn)突變1例、G727D位點(diǎn)突變1例(6.4％);MATN3基因R70H位點(diǎn)突變1例(3.2％)?？偖惓z出率為41.9％。
　　2、23例B超顯示短肢畸形胎兒中，F(xiàn)GFR3基因G380R位點(diǎn)突變5例，提示為軟骨發(fā)育不全;R248C位點(diǎn)突變2例，提示為短肢畸形伴胸廓畸形。兩位點(diǎn)突變陽(yáng)性占短肢畸形的30.4％，均為新發(fā)病例。1

9、例孕婦為先證者的，胎兒產(chǎn)前診斷并未發(fā)生G380R突變。
　　3、先證者ALPL基因第4外顯子R136H突變，第9外顯子V382I突變，提示為低磷酸酶血癥，且來源于父母，第二胎胎兒產(chǎn)前基因檢測(cè)未見突變。
　　4、8例患者高通量測(cè)序結(jié)果顯示:1例為IDS基因R468Q純合突變，提示為粘多糖Ⅱ型。1例為MATN3基因R70H雜合突變，經(jīng)過SIFT蛋白功能預(yù)測(cè)為良性，而PolyPhen蛋白功能預(yù)測(cè)為有害的，疑似多發(fā)性骨骺發(fā)育不良5型

10、;2例為COL1A2基因P857T位點(diǎn)突變和G727D位點(diǎn)突變，均未見報(bào)道，正常人群中未見多態(tài)。
　　5、對(duì)疑似多發(fā)性骨骺發(fā)育不良5型MA TN3基因R70H雜合突變位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)研究顯示，mRNA表達(dá)未見減少，需要進(jìn)一步研究。
　　結(jié)論：小樣本研究顯示短肢畸形疾病譜以軟骨發(fā)育不全為主，其次為成骨不全、粘多糖病、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、低磷酸酶血癥等散發(fā)病例。短肢畸形致病基因篩查首先可使用熱點(diǎn)突變篩選方法對(duì)FGFR3基因檢測(cè)