比較基因組雜交在畸形胎兒非整倍體檢測(cè)及產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分，研究背景：先天性畸形存在于接近100％的新生兒中，潛在致命的先天性畸形的發(fā)生率為2％-3％，是新生兒生后1年內(nèi)死亡的主要原因。其發(fā)病的重要原因是染色體的不平衡。目前經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法一染色體核型分析和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)在研究染色體畸變方面起了重要作用。這兩種方法非常有效，但是也存在明顯的局限性。細(xì)胞遺傳學(xué)方法容易因?yàn)橥獠课廴?、培養(yǎng)失敗或母體細(xì)胞的選

2、擇性生長(zhǎng)導(dǎo)致誤差。FISH技術(shù)應(yīng)用的探針并不適用于所有染色體不平衡的產(chǎn)前篩查，只局限于染色體特定區(qū)域。1992年，Kallioniemi等創(chuàng)建比較基因組雜交(Comparative GetaomicHybridization，CGH)技術(shù)，其基本原理是采用等量的患者基因組DNA(標(biāo)記為綠色)、正?；蚪MDNA(標(biāo)記為紅色)作為探針，并用Cot-1 DNA抑制分散重復(fù)序列，將三者混合后與正常人的中期染色體鋪片進(jìn)行雜交。根據(jù)兩種DNA探針的

3、熒光信號(hào)強(qiáng)度差異來(lái)判斷待測(cè)基因組中DNA的增加或缺失區(qū)域。 目的：建立方便實(shí)用的CGH方法路線，對(duì)通過(guò)超聲檢查確診畸形后引產(chǎn)的胎兒或畸形新生兒進(jìn)行非整倍體篩查，以檢驗(yàn)該方法的敏感性和可靠性，并應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，以提高圍產(chǎn)兒優(yōu)生率。 方法：研究組選取于2006年7月-2007年1月在山東省立醫(yī)院婦產(chǎn)科引產(chǎn)的畸形胎兒5例，宮內(nèi)死亡胎兒1例，出生后發(fā)現(xiàn)畸形新生兒3例。入選病例均在產(chǎn)前檢查時(shí)經(jīng)B超確診畸形或出生時(shí)發(fā)現(xiàn)2種以上的畸形

4、，涉及心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)或泌尿生殖系統(tǒng)，留取5-10ml羊水或2-5ml防凝臍帶血；對(duì)照組采用我院健康查體中心就診的身體健康的男性及女性各1名，抽取清晨空腹肘靜脈血2ml防凝。采用Tiangen公司的DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，Vys i s缺口平移試劑盒標(biāo)記待測(cè)DNA和對(duì)照DNA，每份樣本均分別標(biāo)記SpectrumGreen和SpectrumRed。反應(yīng)條件為15℃作用0.5h

5、-1h以獲得最佳DNA片段(300-3000bp)。將等量的SpectrumGreen標(biāo)記的待測(cè)DNA、SpectrumRed標(biāo)記的正常對(duì)照：DNA與足量的人Cot-1 DNA混勻，醋酸鈉乙醇沉淀DNA，CGH雜交緩沖液重懸制成混合探針，加至正常中期染色體玻片的雜交區(qū)域，73℃共變性，封片后放入密閉濕盒，37℃孵育箱中雜交48-72小時(shí)。在74℃預(yù)熱的0.4XSSC/0.3％NP-40溶液中洗片3-6秒，晾干后放入室溫的2XSSC/0.

6、1％NP-40溶液中洗片1-3秒，DAPI II復(fù)染。使用配備有CCD照相機(jī)和DAPI、SpectrumGreen和SpectrumRecl濾光片的熒光顯微鏡進(jìn)行中期染色體分裂相的選擇、攝像。熒光互換CGH：將待測(cè)DNA和對(duì)照DNA的熒光顏色互換，即SpectrumRed標(biāo)記待測(cè)DNA、SpectrumGreen標(biāo)記正常對(duì)照DNA，二者混勻，其余實(shí)驗(yàn)步驟同上述。使用CGH軟件進(jìn)行圖像分析，選擇5-10個(gè)雜交信號(hào)光滑，背景較低，著絲粒、異

7、染色質(zhì)區(qū)域標(biāo)記探針結(jié)合較少以及DAPI帶型較好的中期染色體，根據(jù)綠紅兩種信號(hào)的比值，分析每一染色體上的熒光強(qiáng)度比(fluoresterme intensity ratio，F(xiàn)R)，即可制作CGH拷貝數(shù)核型模式圖，以1.0表示平衡比例。過(guò)高或過(guò)低的FR閾值可能會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，因此我們將FR閾值定為1.25和0.75，三體或染色體片段的擴(kuò)增定義為FR>1.25，1.5以上視為高水平擴(kuò)增；單體或染色體片段的缺失定義為FR<0.75。

8、 結(jié)果：9例畸形胎兒/新生兒均成功的利用CGH方法進(jìn)行了分析。其中病例4、8、9檢測(cè)出染色體的不平衡并通過(guò)熒光互換CGH得到了確認(rèn)。病例4的基因組DNA標(biāo)記為綠色時(shí)，CGH核型為Dup 21，但在熒光互換CGH中僅檢測(cè)到了21q的擴(kuò)增。由于Cot-1。DNA抑制了標(biāo)記的DNA與著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域的雜交且每個(gè)個(gè)體在此區(qū)域差異較大，以及端粒處的熒光強(qiáng)度會(huì)下降至與背景熒光相似，所以這些區(qū)域一般都不在CGH分析范圍之內(nèi)。因此病例4的C

9、GH核型為Dup 21q；病例8的CGH核型為Del 2p24-pter，Dup 12p13并通過(guò)熒光互換CGH得到證實(shí)；病例9在排除了22p異染色質(zhì)區(qū)域的雜交偏移后，其CGH核型為Del 1p33-pter，Del 22q11-12。其余病例的檢測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)染色體缺失或擴(kuò)增。 結(jié)論：熒光互換CGH能夠減小在DNA標(biāo)記和雜交過(guò)程中出現(xiàn)的偏移，在經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法不可行時(shí)增加非整倍體病例檢出的準(zhǔn)確性和可靠性，可替代染色體顯帶

10、技術(shù)用于非整倍體的篩查。 第二部分，研究背景：唐氏綜合征又稱21三體綜合征或先天愚型，是由于21號(hào)染色體異常而表現(xiàn)為智力中重度低下、特殊面容及各種先天性畸形的綜合征，群體發(fā)病率為1.23‰，占先天智力障礙的50％，在染色體畸變及與先天畸形有關(guān)的染色體疾病中位居首位。因患兒的出生給家庭和社會(huì)帶來(lái)眾多不良影響，且目前尚無(wú)有效治療方法，因此只有進(jìn)行早期診斷，終止妊娠，降低患兒的出生率，才能達(dá)到優(yōu)生的目的。唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查包括孕婦血

11、清標(biāo)志物的篩查和超聲檢查。多項(xiàng)血清標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用篩查唐氏綜合征，結(jié)合孕婦的年齡、孕周、體重及超聲監(jiān)測(cè)，通過(guò)相應(yīng)軟件進(jìn)行計(jì)算，得到胎兒唐氏綜合征的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，對(duì)高危孕婦行羊膜腔穿刺取材、細(xì)胞遺傳學(xué)方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷。羊水細(xì)胞培養(yǎng)和染色體G顯帶分析成功率高，是目前產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。STR是目前應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記，具有高度多態(tài)性和雜合性，聯(lián)合應(yīng)用PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體的多個(gè)STR標(biāo)志，只要有一個(gè)標(biāo)志出現(xiàn)三峰或三條帶，即可做出唐氏

12、綜合征的診斷。STR-PCR方法敏感，所需DNA量少，可用妊娠早期乃至中、晚期羊水獲取胎兒細(xì)胞DNA，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)便，安全性高，還可做到幾十個(gè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行，為開(kāi)展大規(guī)模的產(chǎn)前檢測(cè)提供了技術(shù)保障。 目的：利用21號(hào)染色體上多個(gè)STR多態(tài)性分析快速檢測(cè)胎兒是否唐氏綜合征患兒，陽(yáng)性病例采用比較基因組雜交檢測(cè)，與傳統(tǒng)的染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行比較，確認(rèn)該方法的應(yīng)用價(jià)值。 方法：選擇2006年8月-2006年12月在山東省立醫(yī)

13、院和濟(jì)南市婦幼保健院行唐氏綜合征篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的需進(jìn)行羊膜腔穿刺的孕婦79例，胎兒畸形、死胎或新生兒畸形的孕婦9例作為研究對(duì)象。唐氏綜合征篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦：行羊膜腔穿刺抽取羊水28-30ml，25ml羊水離心后按常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)作染色體分析，剩余3-5ml羊水離心后留取沉淀；發(fā)現(xiàn)胎兒畸形、死胎的孕婦在行利凡諾羊膜腔內(nèi)注射時(shí)留取羊水5-10ml，離心后留取沉淀；畸形新生兒產(chǎn)時(shí)留取臍帶血2-5ml。采用Tiangen公

14、司的DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。選擇21號(hào)染色體的7個(gè)STR位點(diǎn)D21S1432、D21S1414、D21S1413、D21S1437、D21$2039、D21S11和D21S1446來(lái)檢測(cè)胎兒是否罹患唐氏綜合征；選擇X和Y染色體所共有但長(zhǎng)度序列有所不同的Amelogenin基因來(lái)確定胎兒性別。每份樣本分8管進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件如下：DNA反應(yīng)體系20 μl，10×Buffer 2 μl、2.5

15、 mM dNTP 1.6 μl、5 μM上下游引物各2 μl、HS-Taq酶0.1μl、DNA模板n μl(0.05 μg，根據(jù)基因組DNA濃度計(jì)算獲得)、ddH<,2>O(12.3-n)μl。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳確定PCR擴(kuò)增效果，根

16、據(jù)8號(hào)管PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果確定胎兒性別。1-7號(hào)管的PCR產(chǎn)物用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)7個(gè)位STR點(diǎn)的帶型，以確定是否為唐氏綜合征患兒。經(jīng)過(guò)21號(hào)染色體7個(gè)STR位點(diǎn)分析結(jié)果為21三體的樣本，用比較基因組雜交方法進(jìn)行核型分析，與細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果：3-5ml羊水中提取的DNA濃度為0.0386±0.0139μg/μl，最小值為0.0225μg/μl，提取的DNA最少為1.125 μg；9例畸形胎兒或新生兒的

17、羊水或臍帶血標(biāo)本中提取的DNA總量是4-15.65μg，足夠8管PCR反應(yīng)及CGH實(shí)驗(yàn)所需。88例樣本中男性39例，女性49例；檢測(cè)出2例21三體，其中1餅(35號(hào)樣本)來(lái)自唐氏綜合征篩查高危的孕婦，7個(gè)STR位點(diǎn)中D21S1413、D21S2039表現(xiàn)為3條帶，CGH核型為Dup 21，細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果為47，XY，+21；另1例(X4號(hào)樣本)伴有胎兒心血管系統(tǒng)畸形和外觀畸形，7個(gè)8TR位點(diǎn)中D21S1437、D21S2039、D2