染色體非整倍體產(chǎn)前診斷方案的研究.pdf

1、研究背景:
　　 出生缺陷日益成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)。我國(guó)每年約新發(fā)先天殘疾兒童80-120萬(wàn),占出生人口數(shù)的4-6％。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道,出生缺陷將是導(dǎo)致兒童死亡、患病、傷殘及影響生活質(zhì)量的主要因?yàn)椤?0％的出生缺陷是遺傳因素所致,而染色體數(shù)目異常是最常見(jiàn)的遺傳因素,如唐氏綜合征(又名先天愚型)在新生兒中發(fā)病率約為1/600-1/1000,為最常見(jiàn)的染色體疾病,其臨床特征為先天性智力障礙、特殊面容、精神體格發(fā)育遲

2、滯,并伴有其它嚴(yán)重的多發(fā)性畸形,迄今醫(yī)學(xué)上沒(méi)有根治的辦法。根據(jù)中國(guó)優(yōu)生科學(xué)協(xié)會(huì)的推算,我國(guó)每年2000萬(wàn)新生兒中,約有26600個(gè)唐氏綜合征患兒出生,目前我國(guó)大約有60萬(wàn)以上唐氏綜合征患者,每年先天愚型的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)超過(guò)20億元。
　　 產(chǎn)前篩查和診斷的開(kāi)展能在孕早期識(shí)別胎兒的嚴(yán)重先天缺陷,及時(shí)干預(yù),從而減少缺陷兒的出生。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院(American College of MedicalGenetics,ACMG)在1993

3、年指出傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法一核型分析仍是公認(rèn)的診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn),是檢測(cè)染色體非整倍體的主要方法。但檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、影響因素多,且最終的培養(yǎng)結(jié)果有時(shí)不一定能滿足核型分析要求從而能導(dǎo)致核型無(wú)法判讀。鑒于此,研究者發(fā)明了一項(xiàng)檢測(cè)染色體非整倍體的新技術(shù)--熒光原位雜交技術(shù)(flourescence in situ hybridization FISH),它是分子生物學(xué)(探針)與細(xì)胞遺傳學(xué)(染色體)結(jié)合。與核型分析相比,FISH技術(shù)具有快

4、速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠及高度的靈敏性和特異性等優(yōu)點(diǎn),研究報(bào)道FISH能在24小時(shí)甚至更短時(shí)間檢測(cè)孕中期80-95％的染色體數(shù)目異常,且可靠性可達(dá)99.8％以上。隨著臨床應(yīng)用的深化,FISH在產(chǎn)前診斷中得的應(yīng)用在ACMG指南已有所變化。技術(shù)方面,由“需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)的技術(shù)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤跋鄬?duì)成熟的技術(shù)”；臨床應(yīng)用方面由“作為常規(guī)染色體分析的一項(xiàng)輔助檢驗(yàn)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤霸谀撤N程度上是和常規(guī)染色體分析作用相同的技術(shù)”。目前,FISH技術(shù)已成為染色體數(shù)目異常和孕

5、中期快速產(chǎn)前診斷最有效的方法之一。
　　 在臨床實(shí)踐中,傳統(tǒng)核型分析與FISH技術(shù)各有優(yōu)勢(shì),傳統(tǒng)核型分析能檢測(cè)24組染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常,但耗時(shí)耗力,還有培養(yǎng)失敗導(dǎo)致無(wú)法獲得檢測(cè)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。FISH技術(shù)能快速檢測(cè)13、18、21、X及Y五條常見(jiàn)染色體數(shù)目異常,對(duì)其他染色體則有漏診的不足,且試劑成本高昂,限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。不同國(guó)家、地區(qū)的衛(wèi)生醫(yī)療水平和遺傳性疾病種類有所差異,這些因素對(duì)產(chǎn)前診斷方案的制定產(chǎn)生了一定的影響,

6、規(guī)范并指導(dǎo)臨床產(chǎn)前診斷方案勢(shì)在必行。
　　 此外,隨著FISH技術(shù)廣泛開(kāi)展,商業(yè)性試劑盒應(yīng)運(yùn)而生。以往國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷中心主要依賴進(jìn)口探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用,近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷工作的廣泛開(kāi)展和相關(guān)機(jī)構(gòu)的不斷增加及規(guī)范化,國(guó)家日趨重視自主探針的研發(fā)和推廣。臨床實(shí)踐中對(duì)于FISH診斷試劑盒的選擇直接影響到診斷結(jié)果的判讀,因而多層次對(duì)比分析國(guó)內(nèi)外FISH診斷試劑盒的優(yōu)勢(shì),對(duì)指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有積極意義。
　　 目的:
　

7、　 目前,我國(guó)產(chǎn)前診斷仍處于起步階段,無(wú)循征醫(yī)學(xué)及應(yīng)用指南可循。為此,本課題通過(guò)總結(jié)分析產(chǎn)前診斷臨床實(shí)施情況,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建立染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷方案回歸模型。根據(jù)模型得到客觀的依據(jù),結(jié)合孕周及檢查項(xiàng)目收費(fèi)情況,合理應(yīng)用產(chǎn)前診斷指征,遵循成本.效果原則,制定恰當(dāng)?shù)漠a(chǎn)前診斷方案,以明顯提高染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷效力,為我國(guó)現(xiàn)階段的產(chǎn)前診斷提供本地區(qū)實(shí)施的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。同時(shí)對(duì)國(guó)內(nèi)外產(chǎn)前診斷FISH試劑盒進(jìn)行臨床應(yīng)用效果的對(duì)比分析,客觀

8、認(rèn)識(shí)國(guó)產(chǎn)FISH試劑盒的優(yōu)勢(shì)與不足,以便優(yōu)化國(guó)產(chǎn)FISH技術(shù)應(yīng)用的目的。
　　 方法:
　　 1、回顧分析2008年1月至2009年4月在南方醫(yī)院產(chǎn)前診斷和遺傳病技術(shù)中心行產(chǎn)前診斷的435例高危孕婦的臨床資料與診斷結(jié)果,數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)量描述、t檢驗(yàn)、x2檢驗(yàn)和二分類Logistic回歸分析,探討染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷方案模型。
　　 2、按照隨機(jī)數(shù)據(jù)表的原則在435例高危孕婦檢測(cè)標(biāo)本

9、中隨機(jī)選取40例新鮮羊水標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析及兩種FISH診斷試劑(金菩嘉及雅培Vysis)的檢測(cè),對(duì)檢測(cè)指標(biāo)如雜交率、信號(hào)強(qiáng)度、臨床診斷符合率、時(shí)間費(fèi)用成本等進(jìn)行對(duì)比分析。數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)處理。
　　 結(jié)果:
　　 l、產(chǎn)前診斷結(jié)果中,97例標(biāo)本FISH檢測(cè)雜交成功,雜交信號(hào)明亮、清晰集中,易于分析。本研究實(shí)施的213例染色體核型分析中出現(xiàn)4例羊水細(xì)胞培養(yǎng)失敗,2例為假性嵌合體,2例臍血標(biāo)本發(fā)

10、生母源性污染。本研究發(fā)現(xiàn)染色體異常為9例21-三體綜合征,4例18-三體綜合征,1例13-三體綜合征,2例核型為92,xxxx/46,xx的假性嵌合體,2例染色體平衡易位；93例為地中海貧血的單基因疾病。
　　 2、回顧分析435例行產(chǎn)前診斷高危孕婦的病例資料后,以FISH及核型分析為主的產(chǎn)前診斷染色體非整倍體的兩種方案,篩選出核型分析組(213例)和FISH分析組(97例),共310例。對(duì)這310例高危孕婦的產(chǎn)前診斷密切聯(lián)系的

11、10項(xiàng)因素進(jìn)行Pearsonx2、t檢驗(yàn)及Logistic回歸分析,建立染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷方案Logistic回歸模型Y=-2.234+1.685X3-0.543 X5+0.845 x6?；貧w方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.321,df1,P=0.0038)。
　　 3、采用FISH檢測(cè)人均費(fèi)用比核型分析高出2倍左右,兩種診斷方法聯(lián)用費(fèi)用約提高了3倍。
　　 4、孕晚期抽取羊水進(jìn)行FISH或臍血核型分析檢測(cè),兩者檢測(cè)

12、臨床報(bào)告時(shí)間相差1周左右,時(shí)間-風(fēng)險(xiǎn)-成本上FISt{優(yōu)于臍血核型分析。而成本費(fèi)用上,臍血核型分析較優(yōu)。
　　 4、研究結(jié)果表明,兩種FISH試劑雜交率的比較有顯著性差異,(21/13試劑盒p<0.001；18xy試劑盒,P<0.001。)雅培Vysis公司研制的產(chǎn)前診斷試劑盒雜交效果較優(yōu)(21/13探針,0.968±0.012；18xy探針,0.985±0.010)。而金菩嘉公司生產(chǎn)的探針雜交效果主要欠缺在21/13試劑盒上(

13、0.787±0.043),其18xy試劑盒雜交效果可達(dá)90％以上。
　　 5、雅培Vysis公司探針與金菩嘉公司探針信號(hào)強(qiáng)度比較,21/13信號(hào)強(qiáng)度有顯著性差異(P<0.001),雅培VySis公司21/13探針信號(hào)效果優(yōu)于金菩嘉公司。而18xy信號(hào)強(qiáng)度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異,可認(rèn)為金菩嘉公司設(shè)計(jì)的18xy探針信號(hào)強(qiáng)度與雅培VySis公司探針信號(hào)效果相當(dāng)。
　　 6、雅培Vysis試劑使用了雜交儀及快速洗滌方法比金菩嘉操

14、作方法時(shí)間成本節(jié)約了近1小時(shí),而費(fèi)用成本上,金菩嘉試劑成本較為低廉。
　　 結(jié)論:
　　 1、對(duì)本中心實(shí)施的FISH及核型分析這兩種染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷方案,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,由此得到Logistic 回歸方程Y=-2.234+1.685X3-0.543X5+0.845X6,客觀分析了產(chǎn)前診斷涉及的各種因素與診斷方法選擇的關(guān)系,篩選出顯著的影響因素(孕周、超聲檢查及母體血清生化篩查)?；貧w模型提示孕周越大或超聲檢查異常

15、者在產(chǎn)前診斷中多數(shù)選擇核型分析。而母體血清生化篩查異常者更青睞FISH檢測(cè)。孕婦年齡在產(chǎn)前診斷中對(duì)FISH檢測(cè)和核型分析的選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異。在不同的檢測(cè)標(biāo)本中,推薦對(duì)臍血標(biāo)本進(jìn)行核型分析及對(duì)羊水標(biāo)本行FISH檢測(cè)作為孕晚期高危孕婦產(chǎn)前診斷方案。根據(jù)收費(fèi)成本分析,染色體非整倍體產(chǎn)前診斷方法的非侵入性篩查及侵入性診斷收費(fèi)定價(jià)差距小,易導(dǎo)向侵入性診斷。臨床醫(yī)師可參考這項(xiàng)方案的回歸模型,根據(jù)循征醫(yī)學(xué)證據(jù)和高危孕婦個(gè)體差異,擬定適宜的產(chǎn)前診

16、斷方案,避免片面的主觀經(jīng)驗(yàn)及幾個(gè)指標(biāo)異常干擾診斷方案的制定。研究得到的產(chǎn)前診斷方案回歸模型也豐富了我國(guó)產(chǎn)前診斷應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。
　　 2、研究中發(fā)現(xiàn)在排除母源性污染前提下,FISH技術(shù)既能避免核型分析中遇到的羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)制片出現(xiàn)的假性嵌合體和細(xì)胞培養(yǎng)失敗的風(fēng)險(xiǎn),又能利用合理的信號(hào)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)截?cái)嘀禉z測(cè)低水平的嵌合體。因此,FISH技術(shù)不僅是一種快速區(qū)分真假嵌合體可靠方法,又是目前染色體數(shù)目異常和孕中期快速產(chǎn)前診斷最有效的方法之一