SCN1A基因截短突變的NMD機制研究及氨基糖苷類藥物對無義突變翻譯修復的初步探索.pdf

1、【研究背景】
　　SCN1A基因編碼哺乳動物電壓門控鈉通道的α亞基，它是鈉通道的功能性單位，所編碼的蛋白命名為Nav1.1，主要在抑制神經(jīng)元中表達。Dravet綜合征是一種難治性的癲癇性腦病，目前研究已經(jīng)明確SCN1A基因是Dravet綜合征的重要致病基因之一，約70％-80%的Dravet綜合征患者攜帶SCN1A基因異常，其中大約50%基因突變是無義突變和移碼突變,引起蛋白翻譯被提前終止從而生成功能異常的截短蛋白。SCN1A基因

2、截短突變生成提前終止翻譯的密碼子(PTC)，可能會誘導無意密碼子介導的mRNA降解(NMD)發(fā)生，他是一種廣泛存在于真核細胞中的mRNA的質量監(jiān)督機制，該機制通過識別和降解含有PTC的轉錄產(chǎn)物，防止生成功能異常的截短蛋白。SCN1A基因截短突變能否激發(fā)NMD機制，降解含有PTC的mRNA尚無相關研究。
　　目前SCN1A基因截短突變對鈉通道功能的影響機制存在兩種假說，包括單倍劑量不足(Haploinsufficiency)和顯性負

3、效應(Dominant-Negative Suppression)。單倍劑量不足是指單一拷貝正?；蚍g的蛋白質不足以維持正常功能，是導致人類疾病發(fā)生的一個重要因素。顯性負效應是指截短蛋白與野生型(WT)蛋白發(fā)生相互作用而影響野生型蛋白的功能。
　　氨基糖苷類抗生素可以通過提高無義突變的翻譯讀通效率，從而產(chǎn)生全長的蛋白，部分恢復突變體的結構與功能。氨基糖苷類抗生素對SCN1A基因無義突變的翻譯讀通的修復作用尚不明確。
　　【

4、研究目的】
　　本研究選取Dravet綜合征（DS）的患者在SCN1A基因不同位置的截短突變的位點，分析患者的臨床特點與突變信息，使用實驗室前期已構建的相關minigene，研究在SCN1A基因上不同位置的截短突變能否激發(fā)無義密碼子介導的RNA降解機制（NMD），以及下游截短蛋白的表達，分析NMD機制與臨床表型的關系，并選取其中一個無義突變，使用氨基糖苷類抗生素進行不同藥物濃度干預，研究該藥物對SCN1A基因無義突變的翻譯修復的作

5、用。
　　【研究方法】
　　詳細收集本課題所研究的不同位置 SCN1A基因截短突變的 Dravet綜合征（DS）患者的臨床資料及分析突變特點，使用實驗室前期已構建融合表達綠色熒光蛋白（GFP）的不同位置的 SCN1A基因截短突變的 minigene。選取人類神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y細胞）、NGF誘導的褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（NGF誘導的PC12細胞）為質粒轉染對象，使用脂質體法轉染技術，摸索轉染質粒濃度、轉染質粒

6、到提取細胞總RNA所需的間隔時間，確定轉染質粒濃度與轉染后提取總RNA的時間，將去內(nèi)毒素minigene質粒分別轉染上述兩種細胞系，分為放線菌酮（CHX）處理6小時組與未處理組，分別提取細胞的總RNA，經(jīng)逆轉錄得cDNA，以cDNA為模板，Kana基因為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR（Realtime-PCR）。比較SCN1A基因的WT及截短突變型質粒在兩種不同細胞系中的mRNA相對表達量，同時比較CHX處理組與未處理組mRNA相對表

7、達量的變化，每組實驗重復三次獲得均值。將minigene質粒轉染NGF誘導的PC12細胞，48h后提取細胞的總蛋白，進行western blotting檢測，使用光密度法統(tǒng)計 WT及截短突變型質粒蛋白水平變化。選取無義突變 c.4547C>A的minigene質粒轉染NGF誘導的PC12細胞，轉染后18h，加用不同濃度的氨基糖苷類抗生素，藥物處理48h后提取總蛋白，進行western blotting檢測。相對定量數(shù)據(jù)處理(采用2-△△

8、Ct法)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（X±SE)表示，使用SPSS13.0軟件包(SPSS lnc.，Chicago，IL，USA)進行統(tǒng)計分析；兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗，三組以上兩兩比較采用One-Way ANOVA。以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　【結果】
　　1．臨床資料分析：攜帶截短突變c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5621_5622delGG截短突變位點的患者均診斷為SMEI，攜帶

9、截短突變c.5540-5541insCCAG突變的患者診斷為 SMEB，其中攜帶截短突變 c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG的患者同時符合孤獨癥診斷，攜帶c.5540-5541insCCAG患者孤獨癥兒童行為量表(簡稱ABC量表)78分，兒童孤獨癥評定量表（簡稱 CARS量表）36分，而攜帶c.5621_5622delGG突變的患者ABC量表110分，CARS量表41分。
　　2．PEGFP-C

10、2-SCN1A–minigene野生型及突變型質粒鑒定：將實驗室前期已構建野生型 minigene質粒與突變型 c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG的質粒分別使用KpnI、NheI酶切鑒定，并送測序，證實質粒序列正確。
　　3．用于轉染質粒的兩種細胞系內(nèi)源性Kana基因表達的鑒定：經(jīng)過鑒定NGF誘導的PC12細胞,SH-SY5Y細胞均無內(nèi)源Ka

11、na基因表達。
　　4．RNA的質量檢測：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定所制備的totalRNA完整性可以用于熒光定量PCR實驗。
　　5．轉染質粒濃度確定：摸索不同濃度minigenen質粒轉染，SCN1A基因mRNA降解率的變化?？梢?00ng轉染時，降解率最大，選定100ng為最終轉染六孔板的質粒的量。
　　6．質粒轉染后提取totalRNA時間確定：摸索不同時間間隔提取細胞總RNA，SCN1A基因mRNA降解率的變化。1

12、6h提取，降解率最大，選定16h為最終轉染后提取totalRNA的時間。
　　7．熒光定量PCR引物擴增效率鑒定：經(jīng)鑒定Qpcr-NMDegfp-F1、Qpcr-NMDE24-R1與Q-kana-F1、Q-kana-R1兩對引物的擴增效率差異小于5%，可使用2-△△Ct算法。
　　8．Realtime-PCR檢測截短突變SCN1A基因 mRNA的相對表達量：NGF誘導的PC12細胞與SH-SY5Y兩種細胞系中SCN1A基因不

13、同位置截短突變的mRNA均較WT降低，差異有統(tǒng)計學意義；使用CHX處理后，突變質粒的mRNA較相應未處理時均有不同程度的恢復，差異有統(tǒng)計學意義，而WT處理前后變化不大；其中在SH-SY5Y細胞系中，c.5621_5622delGG、c.5540-5541insCCAG mRNA的表達率均較c.4547C>A，c.5280_5281delTG高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　9．截短蛋白western Blotting結果：在NGF誘導的

14、PC12細胞中轉染目的質粒，48h后提取總蛋白，以GAPDH基因為內(nèi)參基因，經(jīng)過統(tǒng)計學分析 c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5621_5622delGG較 WT明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義；c.5540-5541insCCAG與 WT比較無統(tǒng)計學差異； c.5540-5541insCCAG較 c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5621_5622delGG截短蛋白表達水平高，差異有統(tǒng)計學意義

15、。10．氨基糖苷類藥物對無義突變翻譯修復的作用
　　使用不同濃度3mg/ml、6mg/ml慶大霉素處理轉染了c.4547C>A minigene的NGF誘導的PC12細胞，提取總蛋白，western Blotting檢測，可見與WT大小一致的蛋白條帶出現(xiàn)。
　　【結論】
　　1. SCN1A基因截短突變能觸發(fā)NMD機制，不同位置的截短突變所誘發(fā)的NMD機制導致mRNA降解量不同。
　　2. Dravet綜合征患者