產(chǎn)截短側(cè)耳素?fù)?dān)子真菌的抗性突變篩選.pdf

1、截短側(cè)耳素類抗生素對革蘭氏陽性菌和支原體有較強的抗菌活性，同時對部分革蘭氏陰性菌和耐藥菌也有較其他抗生素更優(yōu)的活性。該類抗生素選擇性的結(jié)合于原核生物的核糖體50S亞基，通過抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的活性影響肽鏈的合成與延伸，從而抑制蛋白質(zhì)合成達到抑制細(xì)菌生長的目的，并且不影響真核生物及哺乳動物的蛋白質(zhì)合成。泰妙菌素(Taimulin)和沃尼妙林(Valnemulin)作為獸用藥物，以及Retapamulin作用人用藥物相繼開發(fā)上市，良好的抗菌活性

2、和獨特的抗菌機制都顯示出截短側(cè)耳素類抗生素有廣闊的開發(fā)前景。
　　 截短側(cè)耳素類衍生物通常以截短側(cè)耳素(pleuromutilin)作為原料通過化學(xué)合成或者生物轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)，因此截短側(cè)耳素具有巨大的市場需求。截短側(cè)耳素首先是從傘菌目Pleurotus mutilus和Pleurotus passeckerianus中分離獲得的三環(huán)二萜類抗生素。從截短側(cè)耳素的發(fā)現(xiàn)至今，已報道的具有截短側(cè)耳素生物合成能力的菌種經(jīng)分類研究確定為擔(dān)子

3、菌綱傘菌目菌株，菌種作為微生物發(fā)酵的核心，菌種的改良對于截短側(cè)耳素的生產(chǎn)具有重大意義。由于該類菌種遺傳背景較復(fù)雜，生物合成途徑相關(guān)基因研究較少，誘變選育技術(shù)結(jié)合抗性篩選技術(shù)更加適用。
　　 本文以產(chǎn)截短側(cè)耳素?fù)?dān)子菌綱傘菌目斜蓋菇Clitopilus prunulus-04為出發(fā)菌株進行菌種選育研究，以抗真菌抗生素制霉菌素和特比萘酚，表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)和氯化十二烷基三甲銨(DTAC)作為抗性篩選標(biāo)記。制霉菌素和

4、特比萘酚為抗真菌抗生素，能夠抑制麥角甾醇的生物合成，同時伴隨有細(xì)胞膜通透性的改變；表面活性劑通過改變細(xì)胞膜通透性達到抑菌的作用，因此實驗中選擇這幾個藥物抗性篩選模型。四種藥物對Clitopilusprunulus-04顯示出明顯的抑菌活性，其最小抑菌濃度分別是：制霉菌素6μg/ml、特比萘酚120μg/ml、DTAC35μg/ml、SDBS70μg/ml。在誘變過程中，亞硝基胍(NTG)在0.4mg/ml濃度下，25℃，210r/min

5、振蕩處理30min，致死率達到83.30％，選擇此反應(yīng)體系作為誘變條件。經(jīng)過誘變和藥物抗性篩選后，挑取的單菌落進行初篩復(fù)篩獲得產(chǎn)量提高的耐藥突變株。其中抗生素耐藥突變篩選正突變率較高，制霉菌素正突變率為25.25％，特比萘酚正突變率為21.15％，另外DTAC和SDBS的抗性篩選的正突變率分別是15.28％和15.63％。復(fù)篩獲得制霉菌素耐藥突變株pn163，其截短側(cè)耳素的效價比出發(fā)菌株提高了38.50％，連續(xù)傳代四次有良好的遺傳穩(wěn)定性