截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株重離子誘變及高通量篩選.pdf

1、截短側(cè)耳素(pleuromutilin)是由高等真菌擔(dān)子菌Clitopiluspasseckerianus產(chǎn)生的一種二萜烯類抗生素，對(duì)青霉素-鏈霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。以截短側(cè)耳素為起點(diǎn)人工合成的一系列截短側(cè)耳素類抗生素具有優(yōu)越的抗菌活性，人們認(rèn)為它是對(duì)抗耐藥菌的有力武器，極具研究?jī)r(jià)值，許多新型的截短側(cè)耳素類抗生素正處在研發(fā)上市的各個(gè)階段，因此截短側(cè)耳素類抗生素的國內(nèi)外需求量不斷增大。原料藥截短側(cè)耳素的產(chǎn)量制約著截短側(cè)耳素類抗生素

2、發(fā)展，因此本研究對(duì)截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌進(jìn)行了高產(chǎn)菌株的誘變選育。
　　 選育高產(chǎn)菌株，必須考慮的因素有三個(gè)，誘變方法、發(fā)酵優(yōu)化、篩選方法。前人使用了多種誘變方法選育截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株，但Clitopiluspasseckerianus為高等真菌，修復(fù)能力強(qiáng)，一般誘變劑不能對(duì)其達(dá)到良好的誘變作用。優(yōu)化截短側(cè)耳素發(fā)酵條件，前人多采用單因子試驗(yàn)或者正交試驗(yàn)，試驗(yàn)次數(shù)多，且無法找到最佳因素水平組合。截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌篩選耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，是阻

3、礙其應(yīng)用發(fā)展的重要因素，急待建立快速篩選方法?；谝陨显?，本研究的主要方法與結(jié)果如下：
　　 1.重離子輻照誘變截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌
　　 蘭州近代物理研究所重離子加速器產(chǎn)生的重離子束由于能量大，誘變作用強(qiáng)，突變不易修復(fù)的特點(diǎn)，越來越多的應(yīng)用于微生物的誘變，并取得了良好的效果。本研究首次利用重離子輻照對(duì)截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，并篩選高產(chǎn)菌株。得到了碳離子誘變Clitopiluspasseckerianus的最適誘變方式和

4、最適劑量為離子注入輻照40Gy，為進(jìn)一步利用碳離子輻照誘變Clitopiluspasseckerianus提供了一定的理論依據(jù)，并篩選出一株截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株K40-3，搖瓶效價(jià)達(dá)到16120μg/mL，較出發(fā)菌株提高25.3％。
　　 2.截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的響應(yīng)面法優(yōu)化
　　 本研究利用響應(yīng)面法對(duì)碳離子輻照誘變后篩選得到的高產(chǎn)菌株K40-3進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，并借助于SAS軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，得到的

5、最佳發(fā)酵條件為葡萄糖5.0%、大豆油0.33%、酵母粉0.6%、玉米漿3.0%、MgS040.035%、CaC030.05%、初始pH6.9、裝量35mL/500mL△，截短側(cè)耳素效價(jià)達(dá)到24750μg/mL，在初始發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上提高了53.7%。
　　 3.高通量截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌篩選方法的建立
　　 近年來發(fā)展起來的高通量技術(shù)，由于具有微型化、高效化、低廉化的各種特點(diǎn)，非常適合應(yīng)用于高產(chǎn)菌株的篩選。前人在高通量篩選菌

6、株的研究中已做了大量的工作，建立了多種工業(yè)微生物微量培養(yǎng)和高通量產(chǎn)物檢測(cè)方法，但并沒有適合于Clitopiluspasseckerianus的微量培養(yǎng)方法與產(chǎn)物快速檢測(cè)方法。本研究成功建立了截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopiluspasseckerianus的微量固體發(fā)酵方法和高通量效價(jià)檢測(cè)方法，二者結(jié)合篩選截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株，可以快速測(cè)定一批待測(cè)菌株的效價(jià)，替代常規(guī)搖瓶發(fā)酵菌種篩選，可大大提高截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的育種效率，為截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌