喹噁啉類藥物致突變分子機理的研究.pdf

1、第一章綜述 1.1單細胞凝膠電泳技術(shù) 單細胞凝膠電泳(singlecellgelelectrophoresisassay，SCGE)義稱彗星試驗(cometassay)，是一種快速、靈敏的檢測單個細胞DNA斷裂的技術(shù)，由Ostling[1]等于1984年首次提出，并利用該技術(shù)在中性條件下檢測C射線引起的DNA雙鏈斷裂。1988年，Sing[2]等建立了堿性單細胞凝膠電泳技術(shù)，該技術(shù)不僅可以檢測DNA單、雙鏈斷裂，還可用來

2、檢測堿性不穩(wěn)定位點、DNA交聯(lián)和不完全切除修復(fù)位點等。1996年，Collins[3]等對該方法進行了進一步改進，并利用核酸內(nèi)切酶和甲酰胺嘧啶糖基酶分別檢測了氧化嘧啶和8-羥基鳥嘌呤的損傷。1997年，Santos[4]等首次將SCGE技術(shù)與DNA熒光原位雜交技術(shù)(nuoreseenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)結(jié)合起來，為SCGE技術(shù)的應(yīng)用開辟了新的途徑。我國朱志良博士率先在國內(nèi)建立了彗星-熒光原位雜交技術(shù)體系

3、，并利用該技術(shù)體系發(fā)現(xiàn)人9號染色體是苯代謝產(chǎn)物的靶染色體。 彗星試驗方法適用范圍廣泛，該方法適用于各種體內(nèi)體外試驗，凡是能制成單細胞懸液的各種真核生物細胞均適用于彗星試驗，另外彗星試驗的獨特之處在于，可以檢測單細胞的DNA損傷，這就為受試物毒作用的靶細胞定位提供了可能[5，6，7]。 1.1.1SCGE技術(shù)原理 當各種內(nèi)源性和外源性DNA損傷因子誘發(fā)細胞DNA鏈斷裂時，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細胞裂解液作用

4、下，細胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴散到細胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位：中性條件時，DNA片段可進入凝膠發(fā)生遷移，而在堿處理和堿性電解質(zhì)作用下，DNA發(fā)生解螺旋，DNA環(huán)向外伸展，損傷的DNA斷鏈缺口暴露了陰性電荷，高pH促使DNA變性和解螺旋，從而有利丁單鏈和雙鏈DNA斷片的移動。在電場力作用下，細胞核中帶陰性電荷的DNA斷片離開核DNA在凝膠分子篩中向陽極移動，形成“彗星”狀圖

5、像，DNA鏈缺口越多，進入尾部的DNA越多，表現(xiàn)為尾長和尾部熒光強度增加；未損傷細胞在電泳中DNA仍停留于核中形成圓形熒光團[8，12]。在一定條件下，DNA遷移距離(彗星尾長)和DNA含量(熒光強度)分布與DNA損傷程度呈線性相關(guān)，因此，尾矩(尾部DNA的含量與尾長的乘積)被作為SCGE定量分析的主要依據(jù)[9，22]。 1.1.2SCGE實驗方法 作為檢測DNA原始損傷的試驗，SCGE試驗應(yīng)用哺乳動物要比細菌試驗(DN

6、A修復(fù)試驗和SOS顯色試驗)和噬菌體試驗更有利于將試驗結(jié)果外推于動物和人；另一方面它又比同樣應(yīng)用哺乳動物細胞的姊妹染色單體交換實驗(SCE)和非程序DNA合成試驗(L7DS)的周期人為縮短，不必等到DNA復(fù)制和細胞分裂，因此適用于不能增殖的細胞，只要是活的真核細胞就可以用丁本試驗。 SCGE根據(jù)電泳條件的不同可以分為中性電泳和堿性電泳，中性電泳用于檢測DNA雙鏈斷裂(DSBs)，只限于研究射線和擬輻射化合物對DNA的損傷作用[1

7、]；而堿性處理可檢測SSBs、DSBs和堿性不穩(wěn)定損傷。據(jù)報道許多處理因素造成的SSBs要比DSBs多5～2000倍，因此堿性SCGE大大提高了檢測靈敏度。目前該技術(shù)在世界上很多實驗室應(yīng)用，操作上不斷地進行改良，不斷地融進新技術(shù)[2]。 SCGE基本操作程序如下： 細胞染毒→細胞懸浮液的制備→載玻片凝膠體的制備→細胞裂解→DNA堿性解旋→DNA電泳→中和→染色→圖像觀察→數(shù)據(jù)分析 SCGE樣品細胞需要量少，細胞可

8、米自培養(yǎng)的細胞系或從人、動物和植物活體組織分離的細胞，1995年，Daryl[10]等報道用于SCGE分析的原代細胞將近20種，目前已用過的細胞有人的外周血淋巴細胞、表皮細胞、成纖維細胞、睪丸細胞、腫瘤細胞等；動物有肝細胞、血淋巴細胞；植物細胞等。 細胞存活率是一個重要的參數(shù)，它用來區(qū)分細胞毒性和遺傳毒性，國外比較先進的方法是片j溴化乙錠和5,6-二羧基熒光素雙乙酸酯的雙染料法。5,6-二羧基熒光素雙乙酸酯染色后熒光鏡檢查，活細

9、胞整個呈現(xiàn)綠色，死細胞僅見紅核，正在死亡的細胞則只有綠色顆粒而核呈現(xiàn)現(xiàn)紅色。國內(nèi)通常采用臺酚蘭染色，活細胞不會被染色，而死亡細胞會成監(jiān)色。一般細胞存活率大于80％時認為受試物沒有細胞毒性，可以繼續(xù)進行試驗。但有研究證明臺酚蘭不能檢測細胞活性，它只能說明細胞膜是否完整。最好的檢測方法應(yīng)該是控制對照組細胞不能出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，只能是O級或尾部DNA百分含量在10％左右[11]。 細胞可以冷凍保存，便于日后用于SCGE分析，因為SCGE要