利用TALEN技術(shù)向人誘導(dǎo)多能干細胞引入癲癇相關(guān)SCN1A基因突變.pdf

1、嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇(SMEI)也被稱作Dravet氏綜合征，是一種難以治療的癲癇病。嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇有許多復(fù)雜的病癥，如:嚴重的難治性癲癇癥狀，伴隨發(fā)病的共濟失調(diào)和認知障礙。并且嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇對典型的抗癲癇痙攣的藥物治療都有抵抗作用。多年的研究證明，這種癲癇的遺傳病因是鈉通道的突變。而且由SCN1A基因編碼的電壓門控型鈉離子通道的α亞基是最常見的突變發(fā)生位點。已經(jīng)在嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇病人發(fā)現(xiàn)了不同類型的SCN1A基

2、因突變包括:無義突變，移碼突變，錯義突變，這些突變發(fā)生在SCN1A基因的不同位置。一些研究團隊提出這樣的假設(shè):癲癇病癥的嚴重程度是由突變發(fā)生在SCN1A基因上的位置決定的。然而，至今癲癇的疾病表型與基因型之間的聯(lián)系仍然不確定。一些關(guān)于癲癇的發(fā)病機理的研究表明:引起嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇(SMEI)的基因突變會導(dǎo)致突變鈉離子通道功能的喪失，表現(xiàn)為內(nèi)向鈉電流顯著地減小甚至電流的完全消失?；谝陨蠈嶒炋岢黾僭O(shè):這種減小的鈉電流會造成神經(jīng)系統(tǒng)的

3、超興奮和導(dǎo)致癲癇相關(guān)的痙攣。并且在動物模型上的研究結(jié)果也與這個假設(shè)相符并一致表明那些引起鈉通道功能喪失的突變都會嚴重損傷氨基丁酸(GABA)能抑制性中間神經(jīng)元的鈉電流，從而導(dǎo)致了嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇(SMEI)的超興奮。關(guān)于嬰幼兒嚴重肌陣攣性癲癇(SMEI)的分子致病機理仍需要進一步的研究。
　　TALEN是基因工程中一個重要的高效的工具，它可以在活細胞的基因組的特異的基因序列上切出缺口。TALEN主要是由兩部分組成的。一部分是

4、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)器(TAL)，它是一種黃單胞菌屬的植物病原細菌的毒力因子。這種轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)器(TAL)的原始功能就是在通過細菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)侵染進入宿主細胞后破壞宿主細胞原有的基因調(diào)控系統(tǒng)并且與效應(yīng)器特異性識別的基因組序列結(jié)合。TALEN的另一部分是FokI核酸酶，它可以有效地切割識別的DNA序列，由于可以在體內(nèi)特異性地創(chuàng)造出雙鏈的DNA斷裂缺口(DSBs)，從而被用于基因操作。由于FokI核酸酶只有在二聚體的狀態(tài)下才能切割DNA，所以這些T

5、AL效應(yīng)器的核酸酶(TALENs)在切割DNA缺口時也是成對發(fā)生作用的。然而這些在細胞里的雙鏈缺口(DSBs)可以通過細胞自身的非同源性末端接合(NHEJ)進行修復(fù)，但非同源性末端接合(NHEJ)會損傷打靶基因?qū)胄∑蔚牟迦牒腿笔?。這些雙鏈缺口(DSBs)也可以通過同源重組(HR)進行修復(fù)，但這需要一個同源的DNA片段作為模版去復(fù)制跨過缺口的信息，這種修復(fù)可以被用作基因的插入和替換。
　　到目前為止，科學(xué)家在研究神經(jīng)退行性疾病上

6、遇到了許多困難。人誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSC)技術(shù)可以將人體細胞人工地重編程到一種多能性的狀態(tài)，然后可以將這些多能性的細胞分化成幾乎任何類型的與疾病相關(guān)的細胞、組織，所以它為體外神經(jīng)疾病的建模提供了幾乎無限的疾病相關(guān)的、病人特異性的成體細胞。同時人誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSC)技術(shù)可以避開與胚胎干細胞(ES)相關(guān)的倫理道德問題以及潛在的同種異體的免疫排斥問題?？傊c疾病相關(guān)的基因修復(fù)的病人特異性誘導(dǎo)多能干細胞的獲得是生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開

7、發(fā)領(lǐng)域的一個重大進展。
　　通常，我們會拿病人來源的疾病相關(guān)的細胞系和一株正常人的細胞系作比較，然而這種比較存在很大的缺陷。一方面，神經(jīng)退行性疾病在體內(nèi)通常都有一個較長的潛伏期和一個緩慢的細胞病變過程，而且大部分都是晚年才發(fā)病的。更重要的是，在體外這些疾病的表型都很微弱。另一方面，這兩株細胞系不同的基因背景也為體外研究增加了一個很大的阻礙，因為任何我們觀察到的這兩株細胞系的區(qū)別都不能被定義成到底是疾病相關(guān)的損傷還是因為不同的遺傳背

8、景。所以，要從不可預(yù)知的遺傳背景變化中區(qū)別這些微弱的但是與疾病相關(guān)的表型變化是很困難的，這需要更嚴格的使遺傳背景相匹配的研究方法。
　　因此，為了建立一個遺傳背景確定的實驗系統(tǒng)去研究癲癇的治病機理，我們做的工作主要包括:
　　1、獲得了一株正常人來源的誘導(dǎo)多能干細胞株(iPSCs)，這株誘導(dǎo)多能干細胞株是由皮膚成纖維細胞重編程獲得的并且擁有正常的基因型。然后我們設(shè)計了打靶SCN1A基因的TALEN，并且對這株干細胞的內(nèi)源性基

9、因組(SCN1A)進行了基因修飾。結(jié)合iPSC和TALEN技術(shù)，我們突變了正常人來源的誘導(dǎo)多能干細胞的SCN1A基因，引入了點突變A5768G，于是我們成功構(gòu)建了一株“人造病人”細胞株。
　　2、同時，我們獲得了病人來源的皮膚成纖維細胞，利用重編程技術(shù)將這株細胞重編程為iPS細胞，并利用TALEN技術(shù)，對引起疾病的基因突變進行修復(fù)，構(gòu)建了一株“突變修復(fù)”細胞株。
　　3、基因修復(fù)后，我們檢測了各細胞株的多能性。證明這些iPS

10、細胞株都保持了多能性。
　　4、并且將這些iPS細胞系成功分化成有功能的神經(jīng)元。
　　基于以上所有的工作，我們將研究正常人來源的細胞系和構(gòu)建的“人造病人”細胞系以及病人來源的細胞株和疾病修復(fù)的細胞株，這種情況下，我們感興趣的與疾病相關(guān)的基因病變將是唯一的變量。這種技術(shù)可以成功地對iPS細胞進行疾病相關(guān)的基因操作，并為研究癲癇的治病機理和藥物篩選建立了細胞模型。因此我們希望可以做出更準(zhǔn)確更可信的關(guān)于致病機理的闡述，甚至是對癲癇