CPA1基因和SPINK1外顯子突變在慢性胰腺炎中的致病作用及其機制研究.pdf

1、第一部分中國漢族人群中CPA1功能性突變與特發(fā)性慢性胰腺炎關聯(lián)的鑒定研究
　　研究背景和目的:
　　慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是一種胰腺組織進行性炎癥病變，反復發(fā)作，病程長，嚴重影響患者的生活質量。目前，對慢性胰腺炎發(fā)病機制比較公認的觀點是，遺傳因素、環(huán)境因素及兩者的相互作用共同參與了慢性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展。在過去的20年間，隨著分子遺傳學研究的逐步深入，遺傳因素在慢性胰腺炎發(fā)病機制中占據(jù)了愈

2、發(fā)重要的位置，發(fā)現(xiàn)陽離子胰蛋白酶原基因、陰離子胰蛋白酶原基因、囊性纖維化跨膜轉導調節(jié)因子基因、Kazal1型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因、糜蛋白酶原C基因等在慢性胰腺炎發(fā)病或保護機制起重要作用。
　　2013年，來自德國的一項研究報道了CPA1功能性突變與非酒精性慢性胰腺炎的發(fā)病相關，同時來自歐洲其他地區(qū)的實驗數(shù)據(jù)以及亞洲的兩個小樣本研究數(shù)據(jù)（日本、印度）均支持這一結果。然而，為了證實某一致病基因確與疾病發(fā)生有關，通常需要進行獨立的、不

3、同人種的重復實驗。特別是考慮到上述研究中CPA1功能性突變在不同人種間的發(fā)生及分布情況存在很大差異，亞洲人群僅有兩個小樣本的研究數(shù)據(jù)，以及中國人群慢性胰腺炎易感基因和位點可能有別于歐洲人種的情況，進行獨立的、大樣本的中國人群CPA1功能性突變鑒定研究是非常必要的。
　　本研究的目的是探究中國漢族人群中CPA1功能性突變與特發(fā)性慢性胰腺炎的關聯(lián)，進一步充實中國慢性胰腺炎患者的遺傳特征數(shù)據(jù)，為慢性胰腺炎的精準醫(yī)療打下基礎。
　　

4、研究方法:
　　本實驗納入了1112名中國漢族特發(fā)性慢性胰腺炎患者以及1580名漢族對照人群，采用目標區(qū)域二代測序的方法對其進行CPA1全外顯子以及外顯子/內含子交界處序列的測序研究，并利用Sanger測序法對發(fā)現(xiàn)的CPA1突變進行驗證。對新發(fā)現(xiàn)的CPA1突變，進行CPA1酶活性及分泌情況的功能研究。
　　研究結果:
　　1、本實驗在中國漢族特發(fā)性慢性胰腺炎患者及漢族對照人群中共發(fā)現(xiàn)18個CPA1罕見突變，其中11個突

5、變?yōu)槭状螆蟮馈?br>　　2、經(jīng)過功能研究分析，證實有五個突變?yōu)楣δ苁軗p性突變，分別是p.Glu100Lys，p.Arg240Gln，p.Gly225Ser，p.His306Tyr，p.Glu380Lys。
　　3、在中國漢族人群中，無論是CPA1罕見突變(患者:20/1112(1.8％)vs.對照:24/1580(1.52％);P=0.573），還是CPA1功能受損性罕見突變(患者:3/1112(0.27％)vs.對照:2/15

6、80(0.13％); P=0.410），均與特發(fā)性慢性胰腺炎的發(fā)生無關。
　　結論:
　　1、本試驗首次重復研究了CPA1功能突變與特發(fā)性慢性胰腺炎的關系，是目前樣本量最大的、單一人種的針對CPA1編碼序列及CPA1外顯子/內含子交界處序列的測序研究。
　　2、本研究首次報道了中國漢族人群中CPA1功能性突變與特發(fā)性慢性胰腺炎無顯著關聯(lián)。此結論與歐洲數(shù)據(jù)以及亞洲小樣本研究數(shù)據(jù)不一致，這可能是由于人種遺傳因素特異性所致。

7、
　　3、CPA1功能性突變與慢性胰腺炎的關聯(lián)性在不同人種間存在差異，進一步證明了探究本國人群遺傳因素。
　　第二部分 SPINK1基因外顯子區(qū)域突變對前體mRNA剪接影響的功能研究
　　研究背景和目的:
　　胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑基因(pancreatic secretory trypsin inhibitor，SPINK1)是研究最早、最廣泛的慢性胰腺炎易感基因之一，SPINK1的功能喪失性突變在慢性胰腺炎的

8、發(fā)病過程中起重要作用。目前已報道了32個SPINK1外顯子區(qū)域突變，其致病機理研究主要集中于錯義突變是否影響了蛋白功能。有研究指出基因外顯子區(qū)域突變可以通過產生新的剪接位點，或通過改變與剪接發(fā)生密切相關的多種順勢作用元件，如剪接增強子、剪接沉默子等，影響前體mRNA剪接功能。同時，越來越多的研究報道包括同義突變在內的外顯子區(qū)域突變可通過影響前體mRNA剪接的方式增加患病風險，更有研究預測，在分布于外顯子末端的致病SNPs突變中，有20-

9、45％的突變可能影響剪接功能。此外，minigene模型是常用的分析基因突變對前體mRNA剪接影響的模型。但minigene舍棄了基因的部分內含子或外顯子區(qū)域，可能因此掩蓋了遠端內含子、外顯子對待研究區(qū)域剪接的影響，或改變mRNA二級結構，降低其穩(wěn)定性。
　　本研究的主要目的是使用SPINK1全長基因研究模型，探究SPINK1外顯子區(qū)域突變是否對前體mRNA剪接產生影響，進一步鑒定SPINK1外顯子區(qū)域突變的致病性，明確疾病易感突

10、變的致病機理。同時，通過對比SPINK1全長基因研究模型與SPINK1 minigene研究模型的實驗結果，進一步探討minigene模型給研究結果帶來的可能偏差。
　　研究方法:
　　本課題針對已報道的32個SPINK1外顯子區(qū)域突變進行研究。構建野生型及突變型SPINK1全長基因及minigene載體質粒，轉染HEK293T細胞，通過RT-PCR方法研究突變對基因轉錄本的影響，并用一代測序檢測轉錄本序列;通過Q-PCR的

11、方法研究突變對mRNA相對表達量的影響。利用Alamut軟件對SPINK1外顯子突變進行影響剪接功能的預測分析。
　　研究結果:
　　1、RT-PCR結果顯示SPINK1外顯子突變未導致異常轉錄本產生。
　　2、Q-PCR結果顯示SPINK1突變c.27delC（70.5±9.8，P=0.0092）、c.29G＞A(80.0±4.4,P=0.0029)、c.98_99insA(71.9±1.9,P=0.0015)、c.

12、190A＞G(82.2±4.1,P=0.0170)、c.199C＞T(77.1±10.1，P=0.0070)、c.203A＞G(87.4±7.0,P=0.0365)可致SPINK1 mRNA相對表達量降低。
　　3、c.27delC、c.98_99insA產生提前終止密碼子，NMD抑制劑放線菌酮作用4小時后，可致攜帶c.27delC突變的mRNA表達量回升（126.5±2.2，P=0.0023），對c.98_99insA無影響（1

13、07.2±18.4，P=0.3606）。
　　4、Alamut軟件預測有7個突變可能對原有剪接位點產生影響，e.190A＞G等10個突變可能產生新的剪接位點;預測c.199C＞T、e.98_99insA等12個突變可能降低ESEs活性，有8個突變可能增強ESEs活性。
　　5、對比SPINK1全長基因模型與SPINK1 minigene模型的研究結果發(fā)現(xiàn)，兩種模型的RT-PCR結果相似，均可以顯示c.194+2T＞C突變導致

14、的SPINK1異常轉錄本，且外顯子其它突變對SPINK1轉錄本并無影響。但Q-PCR結果有所不同:minigene模型的研究顯示c.110A＞G（64.1±2.0，P=0.001）、c.137T＞A（131.1±7.9，P=0.0211）、c.194G＞A（44.5±6.4，P=0.0044）可影響mRNA的表達量，而全長基因模型研究未提示突變改變mRNA表達量;c.190A＞G在兩種模型中的研究結果相反，全長基因模型研究顯示該突變可降