不可分型流感嗜血桿菌在呼吸道感染中的免疫應答及細胞內受體TLR9在感染中的表達研究.pdf

1、高級脊椎動物發(fā)展了兩套保護性免疫系統(tǒng)，天然免疫和獲得性免疫。天然免疫系統(tǒng)主要依賴于通過感知病原體相關分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)的蛋白質識別病原體。TLRs(toll-likereceptors)是研究較多的模式識別受體，TLR識別一系列的細菌、真菌及病毒產物，TLR9與其他LTRs不同，存在于細胞內，識別細胞內非甲基化細菌DNA。
　　 呼吸道感染與不可分型流

2、感嗜血桿菌(non-typeableHaemophilusInfluenza，NHTi)具有相關性，特別是肺部及中耳細菌感染，具有一定的發(fā)病率及死亡率。NTHi是一種無莢膜的革蘭氏陰性多形桿菌，常定植于大多數(shù)人的上氣道，在機體氣道表面受損或在粘液纖毛清除功能散失時常常引起機會性感染的病原體。NTHi傳統(tǒng)意義上被認為是一種非侵入性的細胞外細菌，但近期研究表明，NTHi可內化至真核細胞內，侵入上皮細胞及巨噬細胞并在細胞內生存，從而躲避抗菌素

3、的殺菌活性。
　　 我們應用抗菌素保護策略，將細胞同NTHi共孵育2h后；通過高清顯微鏡直觀的觀察NTHi進入到細胞內，NTHi可在胞外產生炎癥反應的同時，內化入細胞內，故NTHi同時作為兼性胞內菌存在；同時，我們構建了急性肺部NTHi感染模型，應用原位雜交技術，在NTHi刺激ALIM4h后，在肺泡腔內可檢測到NTHi的存在。
　　 應用APA策略，定量檢測到NTHi刺激后人上皮細胞A549及外周血單核細胞及肺組織后產生

4、的炎癥因子IL-8和/或TNF-a水平，總炎癥因子與胞內NTHi產生的炎癥因子比較，胞內菌炎癥因子處于非優(yōu)勢地位。ALIM經(jīng)NTHi刺激后有炎癥因子的釋放。活性NTHi所產生炎癥效應同滅活菌比較無顯著差異；細菌成分如細菌DNA，可誘導細胞產生炎癥介質，此作用可被核內體成熟抑制劑氯喹阻斷。
　　 將活性NTHi、滅活的NTHi及細菌DNA刺激上皮細胞A549及外周血單核細胞及ALIM后，通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)TLR9mRNA在

5、細菌或細菌組分刺激后的肺組織、外周血單核細胞上有表達，而在刺激后的上皮細胞A549中的無表達；在RT-PCR基礎上進行流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)TLR9在外周血單核細胞中經(jīng)活性NTHi及細菌DNA激活后有表達增加，氯喹可抑制TLR9的表達，而肺泡上皮細胞A549經(jīng)活性NTHi及細菌DNA刺激不表達TLR9蛋白；Westernblot檢測，ALIM肺組織經(jīng)活性NTHi、細菌DNA及合成的ODNM362刺激后的TLR9有上調，MAPKp38p及E

6、RKp44/42信號通路參與了TLR9的表達。
　　 上述結果表明，氣道及細胞對細菌株的不同應答跟細胞反應類型或菌種相關，并不跟細菌的數(shù)量完全相關。NTHi為傳統(tǒng)意義上被認為是胞外菌，我們的實驗表明NTHi不但能進入胞內，且不單純居留在胞內以躲避抗菌素的殺菌作用，同時仍有一定水平的炎癥因子的釋放，產生炎癥反應；細胞內NTHi刺激細胞表達IL-8及TNF-a的水平大概相當于NTHi刺激細胞總炎癥介質水平的10％至30%。除活性NT

7、Hi外，熱滅活或慶大霉素滅活的NTHi在刺激肺泡上皮細胞或單核細胞及肺組織后，仍可致炎癥介質IL-8或TNF-a表達增加。細胞內細菌及細菌DNA、合成的ODN對機體TLR9介導的單核細胞抗NTHi炎癥防御有一定的作用，且可受氯喹調控。通過RT-PCR檢測TLR9mRNA在細菌或細菌組分刺激后的肺組織、外周血單核細胞上有表達，而在刺激后的上皮細胞A549中的無表達，流式細胞儀檢測TLR9在外周血單核細胞中在活性NTHi及細菌DNA激活后有

8、表達增加，氯喹可抑制TLR9的表達。肺泡上皮細胞A549經(jīng)活性NTHi及細菌DNA刺激不表達TLR9蛋白，Westernblot檢測，ALIM肺組織經(jīng)活性NTHi、細菌DNA及合成的ODNM362刺激后的TLR9有上調，MAPKp38p及ERKp44/42信號通路參與了活性NTH刺激后的TLR9蛋白的表達。
　　 結論：
　　 1.NTHi不但能進入胞內，且在胞內產生炎癥反應；細胞內NTHi刺激細胞表達炎癥介質的水平大概

9、相當于NTHi刺激細胞總炎癥介質水平的10%至30%。NTHi與呼吸道之間相互作用，NTHi可侵入并存留在上皮細胞及單核細胞內，刺激細胞釋放炎癥因子，保持呼吸道處于慢性炎癥狀態(tài)，NTHi的這種作用是COPD急性加重及慢性炎癥的基礎。
　　 2.滅活的NTHi同活性細菌一樣，可產生較強的炎癥反應，而NTHiDNA和合成的ODNM362具有弱免疫活性。
　　 3.外周血單核細胞及肺組織均表達TLR9mRNA及TLR9蛋白，但