慢性阻塞性肺病繼發(fā)感染流感嗜血桿菌的耐藥性分析及RAPD分型的研究.pdf

1、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，HI)主要寄生于人體上呼吸道，屬條件致病菌，在機(jī)體抵抗力降低或局部微生態(tài)平衡失調(diào)時(shí)，入侵機(jī)體引起感染，HI感染以中老年人伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的偏多，近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，流感嗜血桿菌在呼吸道感染的疾病中占有非常重要的地位，嚴(yán)重威脅著人類的健康及生命。由該菌引起感染發(fā)病率一直難以估計(jì)，且流感嗜血桿菌的感染發(fā)病呈上升趨勢(shì)，耐藥率，耐藥范圍有所增加。給臨床治療帶來極大的困難，病死率高。因

2、此在全球范圍內(nèi)引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已經(jīng)成為人類死亡原因的第四位，致死的主要原因是由于呼吸道繼發(fā)感染導(dǎo)致呼吸衰竭，而導(dǎo)致COPD呼吸道感染的病原體中，百分之四十到百分之五十為細(xì)菌，且以流感嗜血桿菌最為多見。若要減少和控制COPD患者繼發(fā)流感嗜血桿菌感染的發(fā)病率和死亡率就要對(duì)流感嗜血桿菌的感染做出早期快速準(zhǔn)確的診斷、采用合理有效的藥物進(jìn)行

3、及時(shí)治療、并迅速掌控菌株流行動(dòng)態(tài)、及早預(yù)防是非常必要的。隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析技術(shù)(Random Amplified Polymorphic DNAAnalysis)——RAPD是一種新的揭示基因組多態(tài)性的快速分型方法。該法所需標(biāo)本量極少，技術(shù)操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，分型及分辨力強(qiáng)。其在臨床中主要用以鑒別二菌株是否同源，即菌株間的相互關(guān)系，以發(fā)現(xiàn)疾病可能的潛在傳染源，治療失敗或反復(fù)感染的原因，以及致病菌在人與人之間的可能傳播途徑。因?yàn)?/p>

4、不同地區(qū)分離的HI菌株對(duì)同一種抗生素的敏感程度不同。因此必須參照本地區(qū)的流感嗜血桿菌的藥敏檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行用藥，應(yīng)避免經(jīng)驗(yàn)性盲目用藥，減少抗生素選擇壓力降低耐藥菌株的產(chǎn)生。因此這項(xiàng)研究對(duì)了解本地區(qū)慢性阻塞性肺病繼發(fā)感染流感嗜血桿菌的現(xiàn)狀、菌株特性、流行趨勢(shì)、耐藥特征、從而為臨床提供合理可靠的用要依據(jù)，及時(shí)控制病原、降低病死率具有十分重要的意義。目的：本研究對(duì)張家口地區(qū)慢性阻塞性肺病繼發(fā)感染流感嗜血桿菌的感染現(xiàn)狀、耐藥情況、流行菌株基因分布特

5、點(diǎn)進(jìn)行分析，以便有效指導(dǎo)臨床合理用藥及時(shí)控制病情發(fā)展。同時(shí)采用RAPD技術(shù)調(diào)查分離的眥菌株在本地區(qū)的流行特征，同時(shí)對(duì)RAPD的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以期建立穩(wěn)定的臨床分型條件體系。 方法：(1)流感嗜血桿菌分離鑒定：規(guī)范采集慢性阻塞性肺病患者痰標(biāo)本并盡快接種于自制的巧克力色平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行流感嗜血桿菌的常規(guī)培養(yǎng)，嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行鑒定。(2)細(xì)菌DNA制備：將收集的濕菌體懸于SE (Somatic Embryo，

6、SE)液中，加入裂解物SDS，60℃水浴10min：加入飽和酚、氯仿-異戊醇，充分振蕩脫蛋白質(zhì)5min：8000r/min離心10min：吸出上層水相，加2倍體積的冰冷無水乙醇，用玻璃棒攪出絲狀沉淀的DNA。等玻璃棒上的乙醇揮發(fā)干，將其溶于TE緩沖液中置4℃?zhèn)溆谩?3)PCR反應(yīng)體系組成與擴(kuò)增條件：反應(yīng)總體積為25μl，4種dNTPs各200μmol/L，TaqDNA聚合酶2.5U，MgCl<,2>濃度2.0mmol/L，引物濃度0.5

7、μmol/L，模板濃度0.05ng/μl。將反應(yīng)成分混合物置于PCR擴(kuò)增儀中， 94℃4min，(94℃40s，30℃40s，65℃2min)×35循環(huán)，72℃5min。(引物、鎂離子、模板濃度、溫度及循環(huán)參數(shù)值的確定采用單因素設(shè)計(jì))(4)取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，于15g/L瓊脂糖凝膠電泳，恒壓80V，2小時(shí)。(5)紫外透射儀下觀測(cè)結(jié)果并攝影。(6)用微量液體稀釋法測(cè)十種抗生素對(duì)36株流感嗜血桿菌的最低抑菌濃度。 結(jié)果：(1)本試驗(yàn)

8、規(guī)范采集慢性阻塞性肺病患者的清晨深咳痰，標(biāo)本共152例，分離出36株流感嗜血桿菌，分離率為23.68％，其中男22例、女14例，年齡53歲至81歲。一附院呼吸科病人21株，“251”醫(yī)院呼吸科病人10株，建國(guó)醫(yī)院呼吸科病人5株。(2)36株流感嗜血桿菌對(duì)10種抗生素的耐藥性呈現(xiàn)不同的結(jié)果，其中四環(huán)素耐藥率為77.78％：SMZ/TMP耐藥率為63.89％；氨芐青霉素耐藥率為47.22％；阿奇霉素耐藥率為33.33％；氯霉素耐藥率為22.

9、22％；環(huán)丙沙星耐藥率為19.44％；頭孢克羅耐藥率為5.56％；阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢呋辛耐藥率為0％。實(shí)驗(yàn)表明近年來張家口地區(qū)慢性阻塞性肺病患者繼發(fā)感染流感嗜血桿菌耐藥性高且耐藥范圍廣，阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢呋辛是本地區(qū)目前治療該菌的首選藥物。供臨床醫(yī)師參考選擇。(3)RAPD分型共有6種不同基因型。其中基因A型一條帶、分子量為600KD、共2株，占5.56％；基因B型三條帶、分子量為600KD、500KD、

10、400KD、共20株，占55.55％；基因C型四條帶、分子量600KD、500KD、400KD、300KD共4株，占11.11％；基因D型五條帶、分子量600KD、500KD、400KD、300KD、200KD共2株，占5.56％；基因E型五條帶、分子量600KD、500KD、400KD、250KD、200KD共2株，占5.56％；基因F型四條帶、分子量600KD、500KD、400KD、200KD共6株，占16.66％。表明基因B型為

11、優(yōu)勢(shì)菌株，是近年來張家口地區(qū)呼吸道感染的主要相關(guān)菌株。(5)RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果：引物濃度為0.5μmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好；DNA模板濃度在0.50ng/μl、2ng/μl均得到了良好的擴(kuò)增效果；鎂離子濃度在2.0m mol/L、4.0 m mol/L時(shí)擴(kuò)增效果較好；退火溫度：在3Q℃時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰；循環(huán)參數(shù)：35、45個(gè)循環(huán)時(shí)擴(kuò)增效果均好。 結(jié)論：(1)基因B型的流感嗜血桿菌是近年來張家口地區(qū)慢性阻塞性肺病呼吸道繼發(fā)感

12、染的主要型別。其它均為散發(fā)。(2)本地區(qū)流感嗜血桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥率較高且耐藥范圍較廣。(3)阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢呋辛都具有較高的抗HI活性，是本地區(qū)目前治療該菌引起呼吸道感染的首選藥物。(4)RAPD分型的靈敏度、特異性及可靠性優(yōu)于其他分型方法，在流行病學(xué)調(diào)查中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。(5)本試驗(yàn)對(duì)RAPD反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了較穩(wěn)定的檢測(cè)條件體系。(6)對(duì)難治的慢性阻塞性肺病繼發(fā)感染的病人，迅速對(duì)其進(jìn)行RAPD檢測(cè)分