流感嗜血桿菌形成生物被膜與慢性阻塞性肺疾患急性發(fā)作相關(guān)性的研究.pdf

1、[目的]觀察流感嗜血桿菌體外生物被膜的形成，并測定氟喹諾酮類藥物莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對流感嗜血桿菌生物被膜的影響。在體外實驗的基礎(chǔ)上，依次建立金黃地鼠肺氣腫模型和慢性阻塞性肺病急性發(fā)作模型，檢測體內(nèi)生物被膜的形成，并進一步觀察莫西沙星對慢性阻塞性肺病急性發(fā)作動物模型體內(nèi)流感嗜血桿菌生物被膜的影響。
　　 [方法](1)從慢性阻塞性肺病急性發(fā)作患者痰液中分離流感嗜血桿菌，采用結(jié)晶紫法和掃描電鏡觀察流感嗜血桿菌體

2、外生物被膜的形成。(2)微量肉湯稀釋法測定不同藥物對流感嗜血桿菌的最低抑菌濃度，觀察氟喹諾酮類藥物對流感嗜血桿菌生物被膜形成和破壞的影響，以及莫西沙星對生物被膜內(nèi)細菌的殺菌作用。(3)采用氣管內(nèi)注入彈性蛋白酶法建立金黃地鼠肺氣腫模型，制作流感嗜血桿菌瓊脂小珠，將其注入肺氣腫動物肺內(nèi)建立慢性阻塞性肺病急性發(fā)作的動物模型，測定隨時間延長肺組織炎癥程度和菌落計數(shù)的變化，利用掃描電鏡觀察氣道表面生物被膜的形成。(4)氣管內(nèi)注入流感嗜血桿菌建立慢

3、性阻塞性肺病急性發(fā)作動物模型，觀察莫西沙星治療后，肺組織病理和氣道表面生物被膜的變化，同時測定炎癥因子和菌落計數(shù)的改變。
　　 [結(jié)果](1)從慢性阻塞性肺病急性發(fā)作患者痰液中分離得到流感嗜血桿菌臨床株可在體外培養(yǎng)24-48小時形成成熟、致密、典型的生物被膜，不同菌株形成生物被膜的能力有所不同，掃描電鏡可在固相支持物表面見到由大量細菌和其分泌的胞外粘質(zhì)形成的模樣結(jié)構(gòu)，并可見到粘液絲和孔道結(jié)構(gòu).(2)流感嗜血桿菌對氟喹諾酮類、阿奇

4、霉素、氨芐西林、頭孢噻肟和利福平敏感，氟喹諾酮藥物可在體外抑制流感嗜血桿菌生物被膜的形成，并有一定的破壞作用；其中莫西沙星隨藥物濃度的升高，生物被膜吸光度值逐漸降低，4mg/L以上濃度的藥物可明顯減輕生物被膜程度；另外莫西沙星對處于生物被膜內(nèi)的細菌仍有強大的清除作用，在0.25mg/L以上濃度膜內(nèi)活菌數(shù)明顯減少，細菌清除作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系.掃描電鏡也證實莫西沙星可明顯減輕生物被膜的程度。(3)成功建立肺氣腫動物模型，病理學檢查可見到肺泡

5、結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡大小不等，肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴張，肺泡壁變薄，肺泡間隔不同程度的斷裂，肺泡腔融合增大，部分融合成肺大泡，符合全小葉型肺氣腫，與正常組相比，模型組的肺泡數(shù)/視野明顯減少，平均肺泡面積和平均內(nèi)襯間隔明顯增大(P<0.01)。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)氣管注入流感嗜血桿菌構(gòu)建慢性阻塞性肺病急性發(fā)作的動物模型，隨時間延長，肺氣腫動物肺內(nèi)炎癥持續(xù)存在；肺泡灌洗液中活菌計數(shù)結(jié)果顯示，與正常動物感染相比，感染后1-3周內(nèi)，灌洗液中細菌數(shù)明顯較

6、高(104.14±0.26 VS.102.47±0.32，P<0.05)：肺組織勻漿活菌計數(shù)結(jié)果顯示，正常動物注入細菌后細菌數(shù)逐漸減少，3周后沒有分離到細菌，而模型動物感染后，細菌得不到清除，1-3周內(nèi)均可分離出較多的細菌(P<0.05)；掃描電鏡觀察，3周后在氣道表面形成生物被膜樣結(jié)構(gòu)。(4)莫西沙星可有效治療流感嗜血桿菌感染所致的肺氣腫動物的急性發(fā)作，鏡下可見到炎癥程度減輕；1周后血漿中炎性因子水平明顯降低(P<0.05)，支氣管肺

7、泡灌洗液中炎性因子水平也有不同程度降低，其中IL-8水平早期就有明顯減少；菌落計數(shù)結(jié)果顯示，1周內(nèi)灌洗液中沒有分離到活菌，肺組織勻漿中活菌數(shù)也明顯下降(P<0.05)，3周后，細菌數(shù)量均再次恢復(fù)；但掃描電鏡沒有發(fā)現(xiàn)生物被膜樣結(jié)構(gòu)。此外，莫西沙星對氣管內(nèi)放置的硅膠管表面形成的生物被膜也有抑制作用，表現(xiàn)為用藥后硅膠管表面分離的細菌數(shù)較少(P<0.05)，掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)在莫西沙星作用下硅膠管表面無法形成成熟的生物被膜，僅見散在的細菌粘附于管壁

8、上，個別有細菌的散在團狀聚集，但尚未融合呈膜狀。
　　 [結(jié)論]從慢性阻塞性肺病急性發(fā)作患者痰中分離的流感嗜血桿菌可在體外形成典型的生物被膜；通過細菌感染肺氣腫動物模型可建立慢性阻塞性肺病急性發(fā)作的動物模型，并且隨時間延長，細菌數(shù)量仍維持在較高水平，同時在氣道表面可找到體內(nèi)生物被膜形成的證據(jù)。結(jié)合體內(nèi)外實驗的結(jié)果，可認為下呼吸道流感嗜血桿菌生物被膜的形成與慢性阻塞性肺病的急性發(fā)作密切相關(guān)，是導(dǎo)致感染反復(fù)出現(xiàn)、病情遷延、治療效果不