肺炎鏈球菌和不可分型流感嗜血桿菌致人肺組織炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制研究.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)和不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus inftuenzae,NTHi)是成人下呼吸道感染(包括社區(qū)獲得性肺炎和慢性阻塞性肺病急性發(fā)作)中最常見(jiàn)和最重要的病原體.Spn和NTHi的發(fā)病復(fù)雜,疾病的轉(zhuǎn)歸涉及細(xì)菌毒力因子和宿主免疫反應(yīng)的平衡.各種宿主細(xì)胞、受體和信號(hào)傳導(dǎo)通路在宿主抵抗Spn和NTHi的過(guò)程中起到重要作用.然而呼吸道上皮細(xì)胞、

2、肺泡巨噬細(xì)胞在上述細(xì)菌所致肺部炎癥反應(yīng)中的作用以及它們與細(xì)菌相互作用的分子機(jī)制并未得到充分闡明. Toll樣受體(Toll-l1ike receptors,TLRs)是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)受體家族.TLR通過(guò)病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)廣泛且特異性地識(shí)別各種病原微生物,激活人體天然免疫,在感染早期發(fā)揮重要作用.在TLR受體家族中,TLR2,4與細(xì)菌發(fā)病的

3、關(guān)系較為密切.TLR下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinascs,MAPKs)通路是調(diào)控真核細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng),參與了細(xì)胞對(duì)外界刺激的多種反應(yīng),包括細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡、細(xì)胞周期、炎癥和應(yīng)激反應(yīng)等.我們目前所掌握的關(guān)于上述病原菌發(fā)病和肺部宿主免疫反應(yīng)的資料大多來(lái)自于動(dòng)物模型,體外細(xì)胞模型研究以及臨床標(biāo)本的橫斷面剖析,而對(duì)于病原菌在人肺臟組織如何與宿主細(xì)胞相互作用以及動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)歸,我們所知甚少.考

4、慮到急性肺炎患者的肺組織標(biāo)本很難獲取,我們從胸科手術(shù)的肺組織標(biāo)本中獲取正常的肺組織,建立Spn和NTHi的肺組織體外急性感染模型(Acute lung infection model,ALIM),作為連接細(xì)胞和整體動(dòng)物模型的橋梁,在組織水平研究肺部疾病的病理生理變化.利用該模型進(jìn)行組織、分子病理學(xué)研究以及功能研究可以展示肺部感染性疾病發(fā)生發(fā)展的連續(xù)橫斷面(snapshot).另外,ALIM模型與COPD慢性持續(xù)性病原感染者的肺組織標(biāo)本相

5、比較,將有助于我們闡明細(xì)菌定植和肺部慢性炎癥持續(xù)存在的可能機(jī)制. 第一部分:人肺組織體外急性感染模型的建立 建立 Spn 和 NTHi 的人肺組織體外急性感染模型 (ALIM):從胸科手術(shù)標(biāo)本中切取距腫塊或結(jié)節(jié)5cm外的正常肺組織,肺組織塊(1cm<'3>)與不同濃度的Spn和NTHi共孵育4h,24h,48h后,收集上清,并取組織塊置于羥乙基哌嗪乙磺酸.谷氨酸介導(dǎo)的具有保護(hù)作用的有機(jī)溶劑(HOPE)中固定.組織上清乳

6、酸脫氫酶(LDH)結(jié)果提示:Spn和NTHi肺組織感染模型可在體外存活48h以上.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)上清白介素(IL)-8顯示:Spn和NTHi以細(xì)菌濃度依賴的方式誘導(dǎo)ALIM炎癥反應(yīng).經(jīng)HOPE溶液處理的肺組織,抽提的RNA完整,無(wú)明顯降解,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)顯示:ALIM中IL-8 mRNA的表達(dá)較未予細(xì)菌刺激組明顯增高.Immunoblot法可檢測(cè)到ALIM組織中βactin蛋白的表達(dá).這提示:HO

7、PE溶液對(duì)肺組織的核酸和蛋白質(zhì)有著良好的保護(hù)作用.ALIM,作為連接人體細(xì)胞和整體動(dòng)物模型的橋梁,使我們可以在組織水平研究肺部感染性疾病發(fā)生發(fā)展的連續(xù)橫斷面變化.ALIM和HOPE固定技術(shù)的結(jié)合為肺部疾病的細(xì)胞和分子發(fā)病機(jī)制研究提供了一個(gè)新的功能研究平臺(tái). 結(jié)論: 1.初步建立了Spn和NTHi的人肺組織體外急性感染模型. 2.HOPE-solution對(duì)肺組織核酸和蛋白質(zhì)有很好的保護(hù)作用,可用于組織形態(tài)學(xué)和分子

8、病理學(xué)的研究. 第二部分:肺炎鏈球菌致人肺組織炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制研究 利用人肺組織體外急性Spn感染模型(ASIM)和體外細(xì)胞培養(yǎng)研究Spn誘導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制.原位雜交(ISH)結(jié)果顯示:Spn感染離體肺組織24-4gh后,在80-90﹪的肺泡巨噬細(xì)胞和15-30﹪的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到Spn-DNA,而支氣管上皮細(xì)胞Spn的感染率極低(<1﹪).用抗生素殺死胞外細(xì)菌,取組織勻漿涂抹羊血瓊脂

9、培養(yǎng)板過(guò)夜后,可見(jiàn)Spn生長(zhǎng).免疫組化(IHC)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,氯膦酸鹽/脂質(zhì)體(Clodronate/liposomes)作用24h后,肺組織中CD68<'+>肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)目無(wú)明顯減少,但是巨噬細(xì)胞中的凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)卻明顯增強(qiáng).同時(shí)Spn刺激后,Clodmnate/liposomes處理組上清中的腫瘤壞死因子(TNF)-α較對(duì)照組顯著降低.這提示Clodronate/liposomes可以通過(guò)誘導(dǎo)肺組織中

10、巨噬細(xì)胞的凋亡來(lái)下調(diào)Spn誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),肺泡巨噬細(xì)胞在Spn所致人肺組織的炎癥反應(yīng)中具有重要作用.定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):Spn刺激24h后,ASIM中TLR-2,4 mRNA的表達(dá)較未感染的肺組織明顯增高.IHC和Immunoblot均證實(shí):ASIM和細(xì)胞感染模型中磷酸化的p38MAPK和ERK MAPK不同程度地表達(dá)上調(diào).分別應(yīng)用功能性TLR-2,4單克隆抗體和p38,ERK MAPK抑制劑阻斷受體和信號(hào)通路,觀察它們對(duì)Spn誘

11、導(dǎo)的肺組織和細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響.ELISA結(jié)果顯示:與阻斷TLR2,4受體和ERKMAPK通路相比,抑制p38 MAPK信號(hào)通路可以顯著降低ASIM上清中IL-8,IL-6,FNF-α的水平.利用肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞株A549,我們證實(shí)p38MAPK是介導(dǎo)Spn所致肺部炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)分子. 結(jié)論: 1.Spn可能是兼性的胞內(nèi)菌,肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可能是Spn在肺部主要的宿主細(xì)胞. 2.建

12、立了肺泡巨噬細(xì)胞失活的體外肺組織模型,該模型可用于研究肺泡巨噬細(xì)胞在各種環(huán)境因素誘導(dǎo)的肺部免疫反應(yīng)中的作用. 3.肺泡巨噬細(xì)胞在Spn誘導(dǎo)的肺組織急性炎癥反應(yīng)中具有重要地位.4.Clodronate/liposomes可能通過(guò)Caspase-3途徑誘導(dǎo)肺組織肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而下調(diào)炎癥反應(yīng).5.P38 MAPK是介導(dǎo)Spn所誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子. 第三部分:不可分型流感嗜血桿菌致人肺組織炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和

13、分子機(jī)制研究 利用人肺組織體外急性NTHi感染模型(AHIM)和體外細(xì)胞培養(yǎng)研究NTHi誘導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制.ISH結(jié)果顯示:NTHi刺激離體肺組織24h后,在70-85﹪的肺泡巨噬細(xì)胞和15-30﹪的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到NTHi-DNA.PCR結(jié)果顯示COPD患者肺組織中NTHi感染率達(dá)35.7﹪(15/42),ISH法證實(shí)肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞NTHi的感染率分別為:40-50﹪和35-45﹪.

14、NTHi在肺組織急、慢性感染中靶細(xì)胞不同的感染率提示:肺泡上皮細(xì)胞可能是NTHi在肺組織長(zhǎng)期定植較為合適的宿主細(xì)胞.IHC和Immunoblot結(jié)果顯示:AHIM和A549細(xì)胞感染模型中磷酸化的p3g MAPK和ERK MAPK不同程度地表達(dá)上調(diào).電泳遷移率檢測(cè)(EMSA)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果顯示:NTHi刺激后,肺組織和A549細(xì)胞內(nèi)核因子NF-κB活性明顯增強(qiáng),并且抑制p38MAPK通路并不影響細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活

15、性.分別用p38 MAPK抑制劑SB2035g0和NF-κB抑制劑PDTC預(yù)先阻斷相關(guān)分子,可以顯著降低感染NTHi的.A549細(xì)胞分泌IL-8因子;而ERK MAPK劑UO126并不能阻斷IL-8因子的分泌.因此,NTHi是通過(guò)NF-κB和p38 MAPK依賴的途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞生成IL-8. 結(jié)論: 1.NTHi可能是兼性的胞內(nèi)菌.肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可能是NTHi在肺部主要的宿主細(xì)胞. 2.肺