γδ T細胞在呼吸道合胞病毒感染影響過敏性氣道炎癥反應中的作用.pdf

1、前言:
　　 支氣管哮喘(bronchialasthma)是由多種細胞、炎癥介質(zhì)及細胞因子共同參與的,以氣道炎癥和氣道高反應性為特征的疾病。Th1/Th2失衡是其主要的免疫學改變,也是氣道炎癥和氣道高反應性發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。病毒感染因影響Th1/Th2平衡而成為哮喘形成和發(fā)作的重要誘因。引起嬰幼兒毛細支氣管炎和肺炎的主要病原體是呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV),其與哮喘的相關(guān)性研究受到高

2、度重視。研究提示RSV感染不僅是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要影響因素,而且RSV感染時機影響機體Th1/Th2平衡及氣道變態(tài)炎癥反應結(jié)果,但在此過程中有哪些因素參與其中并發(fā)揮相應的生物學作用尚不清楚。
　　 廣泛分布于皮膚粘膜系統(tǒng)的γδT細胞作為具有免疫學效應和調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群,影響呼吸道粘膜局部病原體感染模式和過敏性炎癥反應過程。γδT細胞在RSV感染對氣道變態(tài)炎癥反應的影響過程中具有怎樣的生物學作用,目前尚不清楚。為此,本研究利用

3、OVA誘發(fā)的哮喘模型鼠,采用致敏前、后RSV感染模式,深入探討在RSV感染對氣道變態(tài)炎癥發(fā)生發(fā)展影響過程中,γδT細胞的作用以及免疫應答調(diào)控機制。將RSV感染、γδT細胞、過敏性哮喘三者聯(lián)系起來,從新的視角闡明病毒感染影響哮喘形成和發(fā)作的機理,為臨床評價呼吸道病毒感染預后及防治支氣管哮喘提供理論和實驗依據(jù)。
　　 實驗材料和方法:
　　 1、實驗用試劑
　　 試劑:卵清蛋白(OVA)、HE染液、瑞氏染液、膠原酶Ⅰ

4、、DnaseⅠ、淋巴細胞分離液、水合氯醛、RPMI-1640培養(yǎng)液、標準胎牛血清、0.01MPBS緩沖液、紅細胞裂解液、胰酶、熒光標記單克隆抗體(PE-anti-TCRδmAb;FITC-anti-CD40LmAb;FITC-anti-CD69mAb)等。
　　 試劑盒:ELISA檢測試劑盒、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-timeRT-PCR試劑盒。
　　 2、病毒的繁殖與滴定
　　 用Hep-2細

5、胞繁殖人類呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2),30%蔗糖超速離心法分離病毒,-80℃冰箱保存。病毒滴度用組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)表示。
　　 3、實驗性哮喘動物模型
　　 動物:將購于中國科學院上海實驗動物中心的SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為3組,每組8只,分別是實驗組,包括致敏前RSV感染組(RSV/OVA)和致敏后RSV感染組(OVA/RSV)以及對照哮喘組(OVA)。
　　 哮喘模

6、型:小鼠二次腹腔注射0.1ml含20pgOVA和2.25mg氫氧化鋁的乳化液致敏,二次注射間隔為2周。末次致敏后第14天,小鼠吸入超聲霧化的1%OVA生理鹽水20分鐘,每天1次,持續(xù)3天。末次霧化吸入后第2天收集標本。
　　 RSV感染模式:病毒感染時間選擇在初次致敏前第7天(致敏前RSV感染)和末次致敏后第7天(致敏后RSV感染)。經(jīng)鼻粘膜感染20μl含2×106TCID50RSV的病毒懸液。
　　 4、標本采集與檢測

7、方法
　　 (1)肺組織病理標本制作及染色:取模型鼠左肺下葉,制備石蠟切片,常規(guī)HE染色,光學顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥反應情況。
　　 (2)肺組織淋巴細胞的提取:水合氯醛深度麻醉小鼠,經(jīng)心臟灌流去除血管內(nèi)血細胞后取肺組織。用含有200μg/ml膠原酶Ⅰ和30μg/mlDnaseⅠ的培養(yǎng)液消化處理肺組織,淋巴細胞分離液分離肺淋巴細胞。
　　 (3)肺泡灌洗液(BALF)的收集及炎性細胞的分類與計數(shù):用1ml

8、PBS經(jīng)支氣管沖洗肺組織,收集肺泡灌沈液。離心后取細胞懸液作涂片,瑞氏染色后顯微鏡下隨機選擇視野,計數(shù)200個細胞,分別計數(shù)中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量。
　　 (4)ELISA法檢測血清中過敏原特異性抗體含量:10μg/mlOVA包被96孔板,4℃過夜后1%BSA封閉30分鐘,加稀釋的血清樣本培養(yǎng)1小時后,分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體,鄰苯二胺顯色,490nm波長讀取OD值從標準

9、曲線獲取血清抗體含量。
　　 (5)實時熒光定量(Real-time)RT-PCR技術(shù)檢測細胞因子mRNA水平:用RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA,采用Real-timeRT-PCR技術(shù)檢測Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4的mRNA表達水平。
　　 (6)脾細胞分離及其懸液制備:頸椎脫位處死小鼠,常規(guī)無菌制備脾細胞懸液,調(diào)整細胞濃度至1×106/ml。
　　 (7)流式細胞儀檢測脾和肺組織中

10、活化的γδT細胞數(shù)量:調(diào)整小鼠淋巴細胞濃度至1×106/ml。加入PE標記的anti-TCRδmAb以及FITC標記的anti-CD40LmAb或anti-CD69mAb,避光冰浴30分鐘,冷的PBS洗滌兩次,震蕩混勻細胞后上機檢測。
　　 (8)γδT細胞回輸實驗:末次霧化吸入后第2天無菌分離OVA組小鼠脾淋巴細胞,流式細胞分選儀分選PE-anti-TCRδmAb標記的γδT細胞,用RPMI-1640調(diào)整細胞濃度為1×106/

11、ml,從小鼠尾靜脈回輸分選的γδT細胞,2×104/鼠,細胞回輸時間為初次霧化吸入前1小時。
　　 (9)統(tǒng)計學分析:采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析,實驗結(jié)果以-X±S表示,組間比較采用t檢驗分析。P＜0.05判定為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、致敏前感染RSV減輕哮喘鼠肺炎癥反應
　　 經(jīng)OVA致敏和激發(fā)的BALB/c鼠氣道上皮增厚、管腔狹窄、肺組織內(nèi)炎性細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞、中

12、性粒細胞、巨噬細胞數(shù)量明顯增加。致敏前感染RSV顯著抑制OVA誘導的肺炎癥反應,減輕模型鼠肺組織內(nèi)炎性細胞浸潤。但致敏后RSV感染卻對OVA誘發(fā)的氣道炎癥無明顯影響。
　　 2、致敏前RSV感染降低哮喘鼠肺組織內(nèi)炎癥細胞數(shù)量
　　 OVA哮喘鼠肺泡灌洗液中炎性細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞、巨噬細胞數(shù)量明顯增加。致敏前RSV感染降低哮喘鼠BALF中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量,但致敏后RSV感染對小鼠肺炎癥細胞浸潤無明顯

13、影響。
　　 3、致敏前RSV感染降低哮喘鼠血清總IgE和過敏原特異性IgE、IgG1抗體水平
　　 二次腹腔注射和三次霧化吸入明顯升高BALB/c鼠血清總IgE和OVA特異性IgE、IgG1水平。而致敏前RSV感染降低哮喘模型鼠血清總IgE、OVrA特異性IgE和IgG1含量。但致敏后RSV感染對OVA特異性血清抗體的產(chǎn)生無明顯影響。
　　 4、致敏前感染RSV影響哮喘鼠肺細胞Th1/Th2型細胞因子mRNA表

14、達
　　 致敏前RSV感染明顯抑制哮喘鼠肺組織細胞IL-4mRNA的表達,但增強肺局部IFN-γmRNA表達水平。與OVA組相比,RSWOVA組小鼠肺組織IL-4mRNA由0.39±0.08降低至0.28±0.07,而IFN-γmRNA水平由0.11±0.05升高至0.23±0.12。與此相反,致敏后感染RSV對OVA誘導的Th1/Th2型細胞因子mRNA表達水平無明顯影響。
　　 5、致敏前感染RSV降低哮喘鼠脾及肺組

15、織內(nèi)γδT細胞總數(shù)及其活化細胞數(shù)量
　　 致敏前感染RSV顯著降低哮喘鼠脾和肺組織內(nèi)γδT細胞總數(shù),表達CD40L和CD69的活化γδT細胞數(shù)亦因RSV感染而明顯下降。與此相反,致敏后感染RSV則對哮喘鼠脾和肺組織中γδT細胞數(shù)量無明顯影響。
　　 6、γδT細胞參與RSV感染對哮喘鼠氣道變態(tài)炎癥的影響作用
　　 正常小鼠回輸了來自OVA哮喘鼠的γδT細胞后,肺炎性細胞數(shù)量明顯上升,其中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百