TLR信號在呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性免疫病理中的作用.pdf

1、目的：呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原體，接種疫苗是重要的預(yù)防措施，福爾馬林滅活疫苗(RSV)因其疫苗增強(qiáng)性免疫病理(VEP)成為呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗成功研制的主要障礙。已知TLR激動劑作為佐劑可以調(diào)節(jié)疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型。
　　本研究選用三種TLR激動劑（分別為TLR-9配體CpG2216，TLR-2配體PamCys3和TLR-3配體poly（I:C))作為佐劑，同時采用MyD88-/-小鼠，觀

2、察TLR信號增強(qiáng)或抑制后受到RSV攻擊的小鼠肺組織免疫病理的變化，進(jìn)而研究TLR信號在呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性免疫病理中的作用。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)細(xì)胞來源RSV病毒，并測其病毒滴度。
　　2、制備福爾馬林滅活疫苗FI-RSV及對照組疫苗FI-C。
　　3、分別用FI-C,FI-RSV,FI-RSV+CpG2216,FI-RSV+PamCys3,FI-RSV+poly(I:C)免疫C57BL/6野生型小鼠，

3、用FI-RSV免疫M(jìn)yD88-/-C57BL/6小鼠，共免疫三次，正常對照組不免疫。
　　4、用ELISA方法測末次免疫后血清抗體IgG，觀察不同組對體液免疫的影響。
　　5、末次免疫28天后用RSV鼻腔感染小鼠，正常對照組不感染，觀察感染前至感染后5天的體重變化。
　　6、感染第5天，處死小鼠，取小鼠肺組織及肺組織勻漿上清，用實時定量PCR檢測肺組織中RSV病毒N基因(RSV-N),考察病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制情況；EL

4、ISA測肺勻漿上清中細(xì)胞因子IL-4，IL-6，IL-12，IL-17，TNF-α,IFN-γ的含量；考察感染后Th1和Th2應(yīng)答是否平衡以及肺部炎癥反映情況；肺部組織切片經(jīng)HE染色，觀察炎癥浸潤和組織損傷情況；PAS(periodicacidSchiff)染色，觀察氣道粘液分泌情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功培養(yǎng)出RSV，并測定病毒滴度為107.3pfu/ml。
　　2、成功制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)和對照

5、組疫苗(FI-C)。
　　3、ELISA檢測血清IgG結(jié)果：與正常對照組、FI-C對照組比較，各疫苗免疫組均誘導(dǎo)了產(chǎn)生IgG抗體，有顯著性差異(P＜0.05)，各組間IgG水平無顯著性差異(P＞0.05)。說明單獨疫苗與佐劑+疫苗在誘導(dǎo)IgG方面的效果是相似的。
　　4、體重變化情況：與正常對照組相比，各組均有顯著性的體重減輕，各組之間無顯著性差異。
　　5、肺組織染色
　　5.1HE染色的肺組織切片顯示：正常對

6、照組，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無水腫，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；與FI-RSV組相比，F(xiàn)I-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組經(jīng)RSV攻擊后肺部的炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，均有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，肺泡間出現(xiàn)融合和水腫，偶見出血點，而FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSVMyD88-/-C57BL/6組肺部的炎癥反應(yīng)較FI-RSV組明顯減輕。
　　5.2PAS染色的肺組織切片顯示：正常對照組沒有或僅有少量的

7、粘液分泌，F(xiàn)I-control、FI-RSV組、FI-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSVMyD88-/-C57BL/6組經(jīng)RSV攻擊后出現(xiàn)不同程度的粘液增加，F(xiàn)I-RSV+PamCys3組粘液分泌顯著高于FI-RSV組，F(xiàn)I-RSV+CpG2216組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSVMyD88-/-C57BL/6組粘液分泌顯著低于FI-RSV組。

8、r>　　6、實時定量PCR檢測RSV-N結(jié)果顯示：FI-C組明顯被RSV感染，其他各組都得到一定的保護(hù)作用，且佐劑組和FI-RSVMyD88-/-C57BL/6組的保護(hù)效果顯著優(yōu)于FI-RSV野生組(P＜0.05)
　　7、ELISA測肺勻漿液中細(xì)胞因子結(jié)果顯示：FI-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+poly(I:C)組的IL-4、IL-6、IL-12顯著低于FI-RSV組(P＜0.05)，

9、FI-RSVMyD88-/-C57BL/6組顯著低于FI-RSV組(P＜0.05)；FI-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+poly(I:C)組的TNF-α,IFN-γ顯著高于FI-RSV組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSVMyD88-/-C57BL/6組與FI-RSV組無顯著差異(P>0.05)；FI-RSV+PamCys3組和FI-RSVMyD88-/-C57BL/6組的IL-17顯著低于其他組。I

10、FN-γ/IL-4顯示，F(xiàn)I-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+poly(I:C)組顯著低于FI-RSV組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+poly(I:C)組顯著高于FI-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組；FI-RSV+CpG2216組、FI-RSV+PamCys3組無顯著差異(P>0.05)；MyD88-/-C57BL/6組與FI-RSV組無顯著差異(P>0.05)