ILR配體為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:呼吸道合胞病毒是引起嬰幼兒、老年人以及免疫缺陷者下呼吸道感染的重要病原，甚至?xí)斐伤劳?。但是由于疫苗的安全性問題，至今沒有安全有效的疫苗批準(zhǔn)上市。RSV疫苗增強(qiáng)性免疫病理反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制是研究疫苗的關(guān)鍵。TLR配體作為佐劑可能通過調(diào)節(jié)疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型，從而減輕或抑制疫苗增強(qiáng)性免疫病理。本研究選擇了PamCys3(TLR-2的配體)、poly(I∶C)(TLR-3的配體)、LPS(TLR-4的配體)、CpG(TLR-9的配體)為

2、佐劑，與FI-RSV疫苗共同免疫野生型C57BL/6小鼠，并用FI-RSV+Al(OH)3免疫M(jìn)yD88-/-C57 BL/6小鼠作為對(duì)照組之一，研究TLR配體為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1、在Hep-2細(xì)胞上培養(yǎng)RSV,測定RSV滴度。
　　2、制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)和對(duì)照組疫苗(FI-control)。
　　3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　3.1小鼠免疫
　　

3、分別用FI-control, FI-RSV, FI-RSV+CpG2216, FI-RSV+Al(OH)3,FI-RSV+poly(I∶C)，F(xiàn)I-RSV+PamCys3，F(xiàn)I-RSV+LPS免疫野生型C57 BL/6小鼠，用FI-RSV+Al(OH)3免疫M(jìn)yD88-/-小鼠（C57BL/6背景），正常對(duì)照組用PBS免疫。肌肉注射免疫2次，每次間隔2周。
　　3.2體液免疫檢測
　　末次免疫后14天小鼠尾靜脈取血，分離血清

4、，用ELISA檢測抗體IgG、IgG1、IgG2a水平。
　　3.3末次免疫4周后用RSV攻擊被免疫小鼠，每天稱取攻毒小鼠的體重，觀察體重變化。
　　3.4攻毒后5天，處死小鼠，取肺組織、支氣管、肺沖洗液、肺勻漿，做相應(yīng)檢測
　　3.4.1肺組織病理切片，HE染色，觀察炎癥浸潤情況;PAS染色，觀察氣道粘液分泌情況;
　　3.4.2支氣管、肺沖洗液
　　取支氣管、肺沖洗液中的細(xì)胞，瑞氏-吉姆薩染色計(jì)數(shù)炎性細(xì)

5、胞;
　　3.4.3肺勻漿上清
　　用空斑形成實(shí)驗(yàn)滴定病毒滴度;
　　3.4.4血清中和抗體測定
　　用空斑減少實(shí)驗(yàn)測中和抗體滴度;
　　3.4.5 ELISA檢測肺沖洗上清中細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ、 IL-1β的含量;
　　3.4.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測肺組織中IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、T-bet、Gata-3、ROR

6、-γt、 IFN-γ、 RSV-N的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、培養(yǎng)出RSV，并測定病毒滴度107.9 pfu/ml。
　　2、成功制備福爾馬林滅活的疫苗(FI-RSV)和對(duì)照疫苗(FI-control)。
　　3、ELISA間接法檢測小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗體水平。
　　3.1 IgG
　　Control組沒有IgG產(chǎn)生，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+CpG組

7、、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+LPS組IgG含量顯著高于FI-control組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+LPS組IgG含量顯著高于FI-RSV組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+LPS組產(chǎn)生IgG抗體水平顯著高于各佐劑組（P＜0.05）。
　　3.2

8、IgG1
　　Control組、FI-RSV+Pamcys3組和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組無IgG1產(chǎn)生，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+LPS組IgG1含量顯著高于FI-control組、FI-RSV組（P＜0.05），F(xiàn)I-control組和FI-RSV組無顯著性差異(P＞0.05）。
　　3.3 IgG2a
　　Cont

9、rol組、 FI-control組、 FI-RSV+Pamcys3組和 FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組無IgG2a產(chǎn)生，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+LPS組與FI-RSV組IgG2a產(chǎn)生水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　3.4 IgG1/IgG2a
　　FI-RSV+LPS組(0.83)與FI-RSV組(0.96)相比IgG1/

10、IgG2a的比值降低，F(xiàn)I-RSV+CpG組(1.1)、FI-RSV+Al(OH)3組(1.24)、FI-RSV+poly(I∶C)組(1.26)與FI-RSV組(0.96)相比IgG1/IgG2a的比值升高。
　　4、中和抗體
　　Control組無中和抗體產(chǎn)生，F(xiàn)I-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Pamcys3組

11、產(chǎn)生的中和抗體水平顯著高于FI-control組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組和FI-control組無顯著性差異（P＞0.05），F(xiàn)I-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Pamcys3組之間抗體滴度差別不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5、小鼠體重變化（攻毒5天后）
　　與C

12、ontrol組相比，從第二天到第六天除FI-RSV+CpG組外其它各組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，F(xiàn)I-RSV+CpG組從第二天到第四天體重減輕顯著低于Control組(P＜0.05），第五天、第六天FI-RSV+CpG組體重下降與Control組無顯著性差異(P＞0.05）。
　　6、細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示
　　6.1巨噬細(xì)胞
　　各免疫組巨噬細(xì)胞百分比顯著低于Control組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+Pamcy

13、s3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+LPS組顯著高于FI-RSV+CpG組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組和FI-RSV組(P＜0.05），且FI-RSV+LPS組顯著高于FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-control組(P＜0.05)。
　　6.2中性粒細(xì)胞
　　各免疫組中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于Control組(

14、P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+LPS組顯著低于除Control組外其它各組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于其它各組(P＜0.05）。
　　6.3淋巴細(xì)胞
　　各免疫組淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于Control組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+LPS組顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+poly(I∶C)組(P＜

15、0.05)。
　　6.4細(xì)胞總數(shù)
　　各免疫組細(xì)胞總數(shù)顯著高于Control組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+CpG組細(xì)胞總數(shù)顯著高于其它各組(P＜0.05)，其它各免疫組差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　7、肺組織染色Control組、FI-control組、FI-RSV組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+Al(OH)3組、 FI-RSV+poly(I∶C)組、 FI-RSV+PamCys3組、F

16、I-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3 MyD88-/-組
　　7.1 PAS染色的肺組織切片顯示
　　與Control組相比，各免疫組被RSV攻擊后均呈現(xiàn)不同程度的粘液分泌，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組、FI-RSV+Al(OH)3組的粘液分泌量較多，F(xiàn)I-RSV組、FI-RSV+CpG組粘液分泌量次之，F(xiàn)I-control組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+PamCys3組

17、粘液分泌量較少，F(xiàn)I-RSV+LPS組看不到粘液分泌。
　　7.2 HE染色的肺組織切片顯示
　　Control組小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡周圍僅存在少量炎性細(xì)胞;FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+poly(I∶C)組和FI-control組小鼠支氣管周圍和肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞增多，肺泡壁輕微增厚;FI-RSV組、 FI-RSV+CpG組肺泡壁增厚，肺泡間質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞較多，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3MyD88-/-

18、組、FI-RSV+Al(OH)3組小鼠經(jīng)RSV攻擊后肺部氣管周圍浸潤大量炎癥細(xì)胞，肺泡壁增厚，肺泡腔減小。FI-RSV+LPS組偶見少量炎癥細(xì)胞浸潤肺泡間質(zhì)，肺泡壁正常，支氣管周圍偶見少量炎癥細(xì)胞。
　　8、肺勻漿滴定
　　Control組未檢測到病毒，F(xiàn)I-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+CpG組病毒滴度顯著

19、低于FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組、FI-control組（P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組與FI-control組無顯著性差異（P＞0.05）。
　　9、ELISA檢測肺沖洗上清中細(xì)胞因子顯示
　　9.1 IFN-γ
　　FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+PamCys3組IFN-γ含量顯著高于Control組、 FI-RSV組、 FI-RSV+Al(OH)

20、3組、 FI-RSV+LPS組及FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組(P＜0.05)，其余各免疫組無明顯差異(P＞0.05)。
　　9.2 IL-4
　　FI-control組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV組IL-4含量顯著高于Control組、FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組(P＜0.05）， FI-

21、RSV+PamCys3組顯著高于FI-RSV+CpG組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Al(OH)3組(P＜0.05)，其余各組無顯著差異(P＞0.05）。
　　9.3 IL-10
　　FI-RSV組IL-10含量顯著高于Control組和其它免疫組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+CpG組、FI-RSV+PamCys3組IL-10含量顯著高于FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/

22、-組(P＜0.05)。
　　9.4 IL-13
　　FI-RSV+CpG組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV組IL-13含量顯著高于 Control組、 FI-RSV+Al(OH)3組、 FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組P＜0.05); FI-RSV+PamCys3組IL-13含量顯著高于FI-control組、FI-RSV+poly(I∶C)組P＜0.05)，其余各免疫組間

23、無明顯差異(P＞0.05)。
　　9.5 IL-17
　　FI-RSV組IL-17含量顯著高于Control組和各免疫組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組IL-17含量顯著低于FI-RSV+CpG組(p＜0.05），其它各組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　9.6 TNF-α
　　FI-control組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Cp

24、G組FI-RSV+PamCys3組TNF-α含量顯著高于FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組和Control組（P＜0.05），其它各組無顯著性差異(P＞0.05）。
　　9.7 IL-1β
　　FI-RSV組IL-1β含量顯著高于各免疫組與Control組（P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+LPS組顯著低于FI-control組、FI-RSV+CpG組、FI-RSV+PamCys3組(P＜0.05)。
　　9.

25、8 IL-6
　　FI-RSV+PamCys3組IL-6含量顯著高于Control組和其它免疫組(P＜0.05), FI-RSV組IL-6含量顯著高于Control組、FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組(P＜0.05)，其余各免疫組無明顯差異(P＞0.05)。
　　10、RT-PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)顯示
　　10.1 T-bet
　　FI-RSV+CpG組T-bet表達(dá)量顯著高于

26、除FI-RSV+poly(I∶C)以外其它免疫組和Control組(P＜0.05), FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組T-bet表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+LPS組以外各免疫組和Control組(P＜0.05), FI-RSV+LPS組、Control組T-bet表達(dá)量顯著低于FI-control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+PamCys3組、 FI-RSV+poly(I∶C)組、 FI-RSV組(P

27、＜0.05),FI-RSV+LPS組和Control組無顯著差異（P＞0.05）。
　　10.2 IFN-γ
　　FI-RSV+Al(OH)3組IFN-γ表達(dá)顯著高于FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組、FI-control組、FI-RSV+LPS組和Control組（P＜0.05），其它各組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　10.3 GATA-3
　　FI-RSV

28、+Al(OH)3組GATA-3的表達(dá)量顯著高于除FI-RSV組以外其余各免疫組和Control組(P＜0.05), FI-control組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組GATA-3的表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+CpG組以外其余各免疫組和Control組(P＜0.05），另外，F(xiàn)I-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組GATA-3的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組(P＜0.05)。<

29、br>　　10.4 IL-5
　　FI-RSV+Al(OH)3組IL-5表達(dá)量顯著高于其它各組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+LPS組IL-5表達(dá)量顯著低于其它各組(P＞0.05），F(xiàn)I-RSV+CpG組、FI-RSV+poly(I∶C)組IL-5表達(dá)量顯著高于除FI-RSV+Al(OH)3組以外其它各組(P＜0.05)，且FI-RSV+CpG組顯著高于FI-RSV+poly(I∶C)組(P＜0.05)。
　　10.5 IL

30、-10
　　FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組IL-10的表達(dá)量顯著低于Control組和其它免疫組(P＜0.05），且FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組之間無顯著性差異(P＜0.05), FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+PamCys3組IL-10表達(dá)量顯著低于 FI-control組、FI-RSV+CpG組、

31、FI-RSV組(P＜0.05)。
　　10.6 IL-13
　　FI-RSV+CpG組、FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+poly(I∶C)組IL-13的表達(dá)量顯著高于Control組和其它各免疫組（P＜0.05），F(xiàn)I-control組、FI-RSV+LPS組IL-13的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組(P＜0.05)。
　　10.7 IL-17
　　FI-RSV+LPS

32、組IL-17的表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+PamCys3組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組以外其它組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+PamCys3組、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組顯著低于FI-control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV組、FI-RSV+CpG組(P＜0.05)。
　　10.8 ROR-γt
　　FI-RSV+LPS組、

33、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組ROR-γt的表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組以外其它各組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組之間無顯著性差異（P＞0.05），F(xiàn)I-control組、FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組顯著高于FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+CpG組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+po

34、ly(I∶C)組與FI-RSV+CpG組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　10.9 RSV-N
　　各免疫組RSV-N的表達(dá)顯著高于FI-RSV+PamCys3組和Control組(P＜0.05); FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-組RSV-N的表達(dá)顯著高于除FI-control組以外其它各免疫組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+CpG組、FI-RSV+poly(I∶C)組、FI-RSV+Al(OH)3組、F

35、I-RSV+LPS組顯著低于FI-RSV組、FI-control組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、TLR配體作為佐劑促使RSV特異性IgG抗體水平顯著提高，但對(duì)中和抗體無影響;另外，LPS可顯著提高IgG2a水平，降低IgG1/IgG2a的比值。而MyD88缺陷組未見特異性抗體產(chǎn)生。
　　2、疫苗對(duì)免疫小鼠具有保護(hù)作用，TLR配體為佐劑對(duì)疫苗的保護(hù)性無顯著影響。
　　3、TLR4配體LPS作為FI-RSV