CpGODN佐劑對呼吸道合胞病毒重組蛋白疫苗增強性肺部免疫病理的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原，RSV也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。目前認為60年代研制的福爾馬林滅活的RSV(FI-RSV)疫苗導(dǎo)致的病情加劇與伴隨肺部嗜酸性粒細胞浸潤和IL-4、IL-5細胞因子升高的Th2型優(yōu)勢應(yīng)答、中和抗體水平不足、以及缺乏局部免疫等有關(guān)。WHO已將RSV疫苗列為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一，重組亞單位疫苗由于結(jié)構(gòu)清楚并且相對安全而受到RSV疫苗研究者的廣泛關(guān)注。<

2、br>　　 本室前期研究已將G蛋白的抗原活性片段G:125-225(G1)與M2蛋白的CTL表位F/M2:81-95(F/M2)融合表達，經(jīng)Ni+螯合親和層析法純化得到重組蛋白G1F/M2，即RSV重組蛋白疫苗。以Al(OH)3為佐劑免疫小鼠后誘導(dǎo)了特異性CTL，而且與單獨的G1免疫相比，產(chǎn)生了Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答，但是，肺部的Th2型細胞因子IL-4的量顯著高于Th1型細胞因子IFN-γ，即Th2型應(yīng)答仍占優(yōu)勢，RSV攻擊后

3、，肺部的炎癥性病理損傷仍未完全解決。因此需尋求更適合RSV疫苗的佐劑或佐劑組合。
　　 含非甲基化CpG基序的DNA或寡核苷酸（CpG ODN，以下簡稱CpG）是目前已知的最有潛力的佐劑，不僅能刺激固有免疫而且還能激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。CpG是TLR-9的配體，通過激活NF-κB而激活各種免疫細胞，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，特別是CpG促進樹突狀細胞(DCs)產(chǎn)生IFN-γ、IFN-α/β、IL-12、IL-18，促進Th1應(yīng)答，增

4、強CTL活性等；另外，CpG作為新生兒疫苗佐劑具有其獨特的優(yōu)勢；這些正是RSV亞單位疫苗佐劑所需要的性質(zhì)。本研究合成了硫代修飾的CpG佐劑CpG2216（A型）和CpG2006（B型）單獨或與Al(OH)3組合作為佐劑，研究它們對G1F/M2增強的肺部免疫病理的調(diào)節(jié)作用及機制。
　　 方法：
　　 1 用E．coil表達、親和層析純化G1F/M2蛋白。
　　 2 在Hep-2細胞上培養(yǎng)RSV，測定RSV濃度TCI

5、D50。
　　 3 動物實驗
　　 3.1動物免疫：將99只雌性4周齡BALB/c小鼠隨機分為9組，分別為①G1F/M2蛋白+CpG2216組，鼻腔吸入(i．n．)②G1F/M2蛋白+CpG2006組，鼻腔吸入(i．n．)③G1F/M2蛋白+CpG2216組，腹腔注射(i.p.)④G1F/M2蛋白+CpG2006組，腹腔注射(i．p．)⑤G1F/M2蛋白+CpG2216組+Al(OH)3，腹腔注射(i．p．)⑥G1F/M

6、2蛋白+CpG2006組+Al(OH)3，腹腔注射(i．p．)⑦G1F/M2蛋白組，鼻腔吸入(i．n．)⑧G1F/M2蛋白組，腹腔注射(i．p．)⑨PBS組鼻腔吸入(i．n．)。每14天免疫一次，共免疫3次。
　　 3.2體液免疫檢測：末次免疫后18天取血，分離血清，用間接ELISA檢測特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a水平。
　　 3.3細胞免疫檢測：末次免疫后18天，每組處死6只小鼠，取脾臟分離脾細胞。ELISP

7、OT法檢測分泌IL-4和IFN-γ的淋巴細胞水平；流式細胞儀檢測CD4+T或CD8+T效應(yīng)記憶及中央記憶細胞；熒光實時定量檢測細胞因子IFN-γ、IL-5、IL-6、1L-10、IL-12b、IL-13。
　　 3.4用10-676TCID50的RSV攻擊被免疫小鼠，5天后取適量肺組織兩份，一份做病理切片，HE染色觀察肺部病理變化；另一份肺部組織提總RNA用RT-PCR擴增RSV管家基因N來檢測肺部病毒的復(fù)制情況，通過熒光實時定

8、量RT-PCR檢測細胞因子IFN-γ，IL-5，趨化因子Gro-α（中性粒細胞趨化因子），eotaxin(嗜酸性粒細胞趨化因子)，T-bet，GATA3，粘液因子gob-5，來評估疫苗的保護效果和肺部免疫病理。
　　 結(jié)果：
　　 1 成功誘導(dǎo)并純化G1F/M2蛋白。
　　 2 成功獲得TCID50=10-6.76/0.1ml濃度的RSV。
　　 3 體液免疫應(yīng)答
　　 3.1鼻腔免疫途徑：兩種C

9、pG佐劑組誘導(dǎo)的IgG無顯著性差異，與無佐劑組相比亦無顯著性差異；IgG1和IgG2a分別為Th2和Th1型抗體，兩佐劑組誘導(dǎo)的IgG1和IgG2a無顯著差異，但IgG1均顯著低于無佐劑組，而IgG2a顯著高于無佐劑組(P＜0.05)；兩佐劑組IgG1/IgG2a的比值(1.05，1.06)明顯低于無佐劑組(1.25)，以上結(jié)果表明：CpG2216與CpG2006的佐劑效應(yīng)無差異；CpG作為G1F/M2鼻腔免疫途徑的佐劑，對體液免疫應(yīng)答

10、無增強作用，但可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型，使Th1型應(yīng)答升高，Th2型應(yīng)答降低。
　　 3.2腹腔免疫途徑：G1F/M2+CpG2216與G1F/M2+CpG2006組誘導(dǎo)的抗體效價之間均無顯著性差異，同樣G1F/M2+A1(OH)3+CpG2216與G1F/M2+Al(OH)3+CpG2006組之間亦無顯著性差異，表明CpG2216與CpG2006的佐劑效應(yīng)無差異；單獨CpG佐劑組的IgG1明顯低于無佐劑組，而IgG2a明顯高于無

11、佐劑組(P＜0.05)，且前者IgG1/IgG2a的比值(1.00，0.97)明顯低于后者(1.30)，以上結(jié)果表明：CpG對G1F/M2腹腔免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型具有調(diào)節(jié)作用，有利于增強Th1型應(yīng)答，減弱Th2型應(yīng)答。另外，Al(OH)3加CpG雙佐劑組誘導(dǎo)的抗體效價顯著高于CpG佐劑組和無佐劑組，表明Al(OH)3佐劑能顯著增強體液免疫應(yīng)答。
　　 CpG作為鼻腔免疫和腹腔免疫途徑的G1F/M2的佐劑，都能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型

12、，但腹腔免疫途徑效果更好。
　　 4 細胞免疫應(yīng)答
　　 4.1效應(yīng)細胞分泌的細胞因子檢測：第三次免疫后18天，取小鼠脾細胞，提取總RNA，用實時定量RT-PCR擴增Th1型細胞因子IFN-γ和IL-12b、Th2型細胞因子IL-5、IL-6、IL-10、IL-13的基因，結(jié)果顯示各實驗組的細胞因子的表達水平與PBS對照的表達水平均無顯著性差異（數(shù)據(jù)未列出），表明免疫后第18天脾細胞中沒有被激活的效應(yīng)T細胞，只有處于G0

13、期的初始T細胞和記憶T細胞。
　　 4.2 CD4+和CD8+的效應(yīng)記憶和中央記憶細胞的百分率：
　　 CD4+的脾細胞中CD44和CD62L的表達情況：(1)鼻腔免疫途徑，CpG佐劑組和無佐劑組的結(jié)果無差異，均產(chǎn)生了大量的CD44+單陽性細胞（TEM，效應(yīng)記憶細胞），而幾乎沒有CD44+CD62L+雙陽性的TCM細胞；(2)腹腔免疫途徑，G1F/M2+CpG2216組、G1F/M2+CpG2006組和G1F/M2+Cp

14、G2216+A1(OH)3組、G1F/M2+CpG2006+Al(OH)3組既誘導(dǎo)產(chǎn)生了CD44+單陽性TEM細胞，也產(chǎn)生了CD44+CD62L+雙陽性的TCM細胞。其中G1F/M2+CpG2006組產(chǎn)生的TCM細胞與其他組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 CD8+的脾細胞中CD44和CD62L的表達情況：鼻腔免疫組僅產(chǎn)生CD44+單陽性TEM細胞，而腹腔免疫組G1F/M2+CpG2216組、G1F/M2+CpG2

15、006組和G1F/M2+CpG2216+Al(OH)3組、G1F/M2+CpG2006+Al(OH)3組既誘導(dǎo)產(chǎn)生了CD44+單陽性細胞，也產(chǎn)生了CD44+CD62L+雙陽性的細胞。
　　 這些結(jié)果表明：作為鼻腔免疫佐劑CpG主要促使G1F/M2誘導(dǎo)效應(yīng)記憶細胞，而作為腹腔免疫佐劑則有助于G1F/M2刺激產(chǎn)生中央記憶細胞，其中CpG2006效果最顯著。4.3分泌IFN-γ和IL-4的淋巴細胞的水平：
　　 取脾細胞，用G

16、1F/M2蛋白體外刺激，激活記憶細胞，使其分泌細胞因子。結(jié)果顯示：(1)鼻腔免疫佐劑組分泌IFN-γ和IL-4的淋巴細胞數(shù)均顯著多于無佐劑組(P＜0.05)；無論是CpG佐劑還是無佐劑組，分泌IFN-γ的淋巴細胞數(shù)顯著多于分泌IL-4的淋巴細胞數(shù)(P＜0.05)，即Th1優(yōu)勢型免疫記憶。(2)腹腔免疫各佐劑組均誘導(dǎo)了大量的分泌IFN-γ的淋巴細胞，顯著多于無佐劑組(P＜0.05)，且CpG2006組的細胞數(shù)顯著多于CpG2216組，Cp

17、G2006+Al(OH)3組顯著多于CpG2216+Al(OH)3組(P＜0.05)；對應(yīng)的各組所產(chǎn)生的分泌IL-4的淋巴細胞數(shù)均顯著少于分泌IFN-γ的淋巴細胞數(shù)(P＜0.05)，即各組均誘導(dǎo)了Th1優(yōu)勢型免疫記憶。但是，CpG與Al(OH)3混合使用組均誘導(dǎo)了大量的分泌的IL-4淋巴細胞，顯著多于其他各組，而單純CpG組的分泌IL-4淋巴細胞數(shù)與無佐劑組之間無顯著性差異，表明CpG+Al(OH)3同時增強Th1和Th2型免疫記憶。C

18、pG佐劑組分泌IFN-γ和IL-4的淋巴細胞數(shù)的比值(42.00，20.43)明顯高于無佐劑組(5.96)，而CpG+Al(OH)3佐劑組(4.24，3.16)低于無佐劑組，表明CpG佐劑促進G1F/M2蛋白疫苗誘導(dǎo)Th1記憶細胞。
　　 結(jié)果表明無論是鼻腔免疫還是腹腔注射免疫，CpG單獨作為佐劑或與Al(OH)3聯(lián)合作為佐劑均誘導(dǎo)了Th1為主的Th1/Th2混合應(yīng)答；CpG與Al(OH)3聯(lián)合做為佐劑可同時增強Th1型和Th2

19、型免疫記憶；而在誘導(dǎo)Th1型優(yōu)勢免疫記憶方面，CpG單獨使用強于兩種佐劑聯(lián)合使用，且腹腔注射免疫比鼻腔免疫效果好。
　　 5 RSV攻擊被免疫小鼠后，肺部的病毒復(fù)制和免疫病理
　　 5.1肺部病毒復(fù)制情況：用半定量RT-PCR和實時定量RT-PCR檢測肺組織RSV管家基因N的表達量，結(jié)果見圖1和表1：PBS組肺組織N基因的表達量顯著高于各實驗組；有佐劑的各組N基因的表達量顯著低于無佐劑組。這些結(jié)果表明：當(dāng)RSV感染時，無

20、佐劑的G1F/M2、CpG以及CpG+A1(OH)3佐劑化的G1F/M2均能對被免疫小鼠起到保護作用，而且佐劑化的G1F/M2保護效果更好。
　　 5.2肺部炎癥性介質(zhì)、Th1/Th2細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達：用實時定量RT-PCR檢測肺組織中這些分子的表達，CpG2006+ G1F/M2(i．p．)的IFN-γ/IL-4比值顯著高于其他各組，表明該組呈現(xiàn)顯著的Th1應(yīng)答；另外該組的嗜酸性粒細胞和中性粒細胞趨化因子eotaxin

21、和Gro-α均顯著低于無佐劑組和聯(lián)合佐劑組，表明該組的炎癥細胞浸潤可能低于無佐劑組和聯(lián)合佐劑組。從粘液因gob-5的表達情況看，鼻腔免疫顯著低于腹腔免疫組。
　　 5.3病理切片檢測：CpG2006+ G1F/M2(i．p．)組的炎性細胞浸潤比顯著少于其他各組。
　　 結(jié)論：
　　 1 CpG與Al(OH)3聯(lián)合使用，對G1F/M2誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答有顯著增強作用。CpG作為G1F/M2的佐劑，對體液免疫應(yīng)

22、答無增強作用，但可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型，使Th1型應(yīng)答升高，Th2型應(yīng)答降低。
　　 2 CpG佐劑可顯著增強G1F/M2誘導(dǎo)的Th1型免疫記憶，而且CpG2006比CpG2216效果更好；CpG與Al(OH)3聯(lián)合使用，可同時增加Th1和Th2記憶細胞。CpG通過腹腔注射可以顯著刺激CD4+T細胞和CD8+T細胞的CD44+CD62L+雙陽性的中央記憶細胞。
　　 3 各免疫組小鼠對RSV都起到了很好的保護作用，而且佐