巖白菜素在Wistar大鼠體內(nèi)、混合人肝微粒體及UGT重組酶體外的代謝研究.pdf

1、目的:
　　1.建立靈敏度高、專屬性強(qiáng)、方便可行的HPLC-QTOF-MS/MS法測(cè)定Wistar大鼠生物樣本中的巖白菜素及巖白菜素代謝產(chǎn)物。
　　2.獲得巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)碎片離子，推測(cè)其二級(jí)碎片裂解方式。
　　3.測(cè)定灌胃給予巖白菜素混懸液后大鼠生物樣本中的代謝產(chǎn)物。
　　4.根據(jù)測(cè)得的巖白菜素代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)推測(cè)巖白菜素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。
　　5.確定巖白菜素在混合HLMs孵育體系中的

2、最佳混合HLMs濃度和最佳孵育時(shí)間。
　　6.建立靈敏度高、穩(wěn)定性好、方便可行的HPLC-MS/MS法、HPLC法測(cè)定巖白菜素的葡糖醛酸化代謝產(chǎn)物。
　　7.研究β-D-葡萄糖醛酸苷酶對(duì)葡糖醛酸化巖白菜素的水解作用。
　　8.考察巖白菜素在UGT重組酶孵育體系中的葡糖醛酸化反應(yīng)。
　　9.測(cè)定巖白菜素葡糖醛酸化的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　10.考察13個(gè)個(gè)體的HLMs中巖白菜素和膽紅素葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性的相關(guān)性分

3、析。11.考察UGT1A1重組酶抑制劑保泰松、底物雌二醇和膽紅素對(duì)巖白菜素葡糖醛酸化反應(yīng)的抑制作用。
　　方法:
　　1.Agilent6538 HPLC-QTOF-MS/MS儀器進(jìn)行樣本分析，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相比例為5％-95％B(0-20 min)，95％B(20-22 min)，95％-5％(22-25 min)，流速:0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL，每個(gè)樣本進(jìn)樣完成后平衡10 min。

4、　　2.配制500 ng/mL巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-QTOF-MS/MS全掃描和子離子掃描(MS2)分析。
　　3.分別采集灌胃給藥前和給藥后Wistar大鼠生物樣本，對(duì)樣本沉淀蛋白處理后，進(jìn)樣HPLC-QTOF-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行全掃描分析，對(duì)比給藥前與給藥后生物樣本總離子色譜圖提取的準(zhǔn)分子離子，對(duì)可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行二級(jí)碎片掃描(MS2)分析，根據(jù)特征性二級(jí)碎片確定巖白菜素代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
　　4.根據(jù)巖白菜素及代

5、謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)推測(cè)巖白菜素在Wistar大鼠體內(nèi)代謝途徑。
　　5.巖白菜素分別在0.25、0.5、0.8、1.0、1.25 mg/mL混合HLMs孵育體系中孵育30 min后終止反應(yīng)考察混合HLMs最佳孵育濃度。0.8 mg/mL混合HLMs孵育體系分別在孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80 min后終止反應(yīng)，考察孵育體系的最佳孵育時(shí)間。
　　6.巖白菜素分別與含有UDPGA的有活性或高溫滅活后的混合HLM

6、s孵育體系進(jìn)行孵育，采用HPLC-MS/MS方法對(duì)巖白菜素葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。Diamonsil C18色譜柱(150×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇∶0.1％甲酸水=30∶70(V/V)，在線脫氣;流速0.4 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL，ESI離子源，分別采用正、負(fù)離子模式對(duì)樣本進(jìn)行分析，采用全掃描(scan)、選擇離子檢測(cè)(SIM)及子離子掃描(Product Ion Scanning)模式對(duì)樣本進(jìn)行分

7、析。采用HPLC-UV方法對(duì)巖白菜素葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，Diamonsil C18色譜柱(150×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇∶0.1％甲酸水=15∶85(V/V);流速1 mL/min;柱溫室溫;監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)272 nm;進(jìn)樣量20μL。
　　7.多個(gè)巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本在混合HLMs孵育體系中孵育30 min加入終止液終止反應(yīng)，收集、混合所有樣本的上清液，并分為兩組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組重復(fù)3個(gè)樣本，所有樣本40℃

8、水浴N2吹干后，實(shí)驗(yàn)組采用500μL含2000單位β-D-葡萄糖醛酸苷酶的0.05M醋酸鈉緩沖液復(fù)溶，對(duì)照組采用500μL不含β-D-葡萄糖醛酸苷酶的0.05 M醋酸鈉緩沖液復(fù)溶。復(fù)溶樣本37℃水浴中孵育4h后取出100μL用終止液中終止反應(yīng)， HPLC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)樣分析。
　　8.采用50，250，500μM巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與滅活的或未滅活的不同UGT重組酶進(jìn)行孵育。
　　9.巖白菜素系列濃度分別在混合HLMs和

9、UGT1A1重組酶進(jìn)行孵育，測(cè)定葡糖醛酸化巖白菜素的濃度，擬合酶動(dòng)力學(xué)曲線，并根據(jù)米氏公式計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值、Vmax、 CLint(Vmax/Km)。
　　10.250μM巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液和100μM膽紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與13個(gè)不同個(gè)體的HLM進(jìn)行孵育，分別測(cè)定葡糖醛酸化巖白菜素和葡糖醛酸化膽紅素的濃度，計(jì)算其代謝速率。由葡糖醛酸化巖白菜素代謝速率對(duì)葡糖醛酸化膽紅素代謝速率做直線分析，所得相關(guān)系數(shù)(r)評(píng)價(jià)兩藥相關(guān)性，P＜0.

10、05認(rèn)為有顯著性差異。
　　11.250μM巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與有活性混合HLMs或UGT1A1重組酶孵育體系進(jìn)行孵育作為陽(yáng)性對(duì)照組，與高溫滅活的混合HLMs或UGT1A1重組酶孵育體系進(jìn)行孵育作為陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別采用250μM巖白菜素與10-500μM保泰松、雌二醇、膽紅素與有活性混合HLMs或UGT1A1重組酶孵育體系共同孵育。采用HPLC法分別測(cè)定陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組的素葡糖醛酸化巖白菜的濃度，分別計(jì)算保

11、泰松、雌二醇、膽紅素對(duì)巖白菜素的IC50。
　　結(jié)果:
　　1.HPLC-QTOF-MS/MS法測(cè)定Wistar大鼠生物樣本中的巖白菜素及巖白菜素代謝產(chǎn)物靈敏度高、專屬性強(qiáng)、方便可行。
　　2.進(jìn)樣分析巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，巖白菜素的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z327.0718。m/z327.0718的主要二級(jí)碎片離子為m/z312.0491，249.0407，234.0169，207.0295，192.0061。

12、>　　3.對(duì)灌胃給藥前后的大鼠生物樣本總離子流色譜圖進(jìn)行提取離子分析，對(duì)比給藥前和給藥后生物樣本中的準(zhǔn)分子離子，找出了幾種可能的代謝產(chǎn)物，并根據(jù)其MS2信息進(jìn)一步推測(cè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在膽汁、尿液及糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了巖白菜素(M0)(m/z327.07)及其代謝產(chǎn)物M1和M1'(m/z503.11)，M2和M2'(m/z407.03)和M3(m/z359.10)，在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了巖白菜素(M0)(m/z327.07)及其一種代謝產(chǎn)

13、物M3(m/z359.10)。
　　4.根據(jù)巖白菜素代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)推斷巖白菜素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑為葡糖醛酸化、硫酸化、水解合并甲基化三種途徑。
　　5.巖白菜素在不同濃度(0.25、0.5、0.8、1.0、1.25 mg/mL)混合HLMs孵育體系中孵育30min后，結(jié)果顯示0.8 mg/mL混合HLMs孵育體系中巖白菜素的代謝率在25％左右;巖白菜素在0.8 mg/mL混合HLMs孵育體系中分別孵育0、10、20、30、4

14、0、50、60、70、80 min后終止反應(yīng)，結(jié)果顯示孵育30 min時(shí)巖白菜素濃度的代謝率在25％左右，最終確定巖白菜素孵育體系的混合HLMs最佳孵育濃度為0.8 mg/mL，最佳孵育時(shí)間為30min。
　　6.巖白菜素分別與含有UGDPA的有活性或高溫滅活后混合HLMs孵育系統(tǒng)孵育后，HPLC-MS/MS法對(duì)樣本進(jìn)行定性分析，對(duì)比兩組樣本的質(zhì)譜圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)有活性的混合HLMs孵育組有準(zhǔn)分子離子峰m/z503.1([M-H]-)，

15、與巖白菜素的準(zhǔn)分子離子峰m/z327.1相差176 Da，且其二級(jí)碎片中含有葡糖醛酸基團(tuán)的特征性碎片m/z175和112.9，最終確定該代謝產(chǎn)物為葡糖醛酸化巖白菜素。HPLC法對(duì)葡糖醛酸化巖白菜素的定量分析重現(xiàn)性好、精密度高，穩(wěn)定性好，與雜質(zhì)分離完全，適用于酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。
　　7.經(jīng)β-D-葡萄糖醛酸苷酶水解的代謝樣本中，葡糖醛酸化巖白菜素消失，巖白菜素原形藥的增加與減少的葡糖醛酸化巖白菜素一致，未添加β-葡萄糖醛酸苷酶的對(duì)

16、照組中葡糖醛酸化巖白菜素及巖白菜素原形藥未見(jiàn)變化。
　　8.50、250、500μM的巖白菜素分別與不同的UGT重組酶(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10、2B4、2B7、2B15、2B17)孵育后，結(jié)果顯示只有UGT1A1重組酶中發(fā)生了代謝，產(chǎn)生巖白菜素葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。
　　9.5μM-1 mM巖白菜素經(jīng)混合HLMs及UGT1A1重組酶孵育體系孵育后所得葡糖醛酸化巖白菜素的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

17、Km值、Vmax、 CLint(Vmax/Km)結(jié)果分別為231.62±14.08和200.37±26.73μM，2.17±0.21和1.88±0.26 nmol/min/(mgprotein)，9.39和9.38μL/min/(mg protein)。
　　10.巖白菜素葡糖醛酸活性與重組人UGT1A1探針底物膽紅素葡糖醛酸活性具有顯著相關(guān)性(R2=0.9629，P＜0.01)。
　　11.在混合HLMs和UGT1A1重組

18、酶孵育體系中UGT1A1重組酶的抑制劑保泰松，底物雌二醇和膽紅素對(duì)250μM巖白菜素的IC50分別為92.89±6.3和77.3±7.3，112.98±12.4和97.27±15.6,68.55±8.2和59.57±11.7μM。
　　結(jié)論:
　　1.本研究利用HPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)分析灌胃給藥巖白菜素前和給藥后大鼠的膽汁、血漿、尿液和糞便樣本，分析可能的代謝產(chǎn)物，利用二級(jí)碎片推測(cè)其結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠膽汁、血

19、漿、尿液、糞便樣本中共存在巖白菜素3種可能的代謝產(chǎn)物(M1和M1' m/z503.11，M2和M2' m/z407.03，M3 m/z359.10)，分別為葡糖醛酸化、硫酸化、水解合并甲基化三種代謝途徑。
　　2.巖白菜素的體外代謝研究發(fā)現(xiàn)，在UDPGA存在的混合HLMs孵育體系中巖白菜素發(fā)生葡糖醛酸化反應(yīng)，UGT1A1重組酶為巖白菜素葡糖醛酸化的主要代謝酶。UGT1A1重組酶的抑制劑保泰松，底物雌二醇和膽紅素均對(duì)混合HLMs和U