人肝微粒體CYP450酶代謝活性的個(gè)體內(nèi)差異與相關(guān)性.pdf

1、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)為一類含亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，它是肝臟微粒體混合功能的氧化酶，主要包括CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4、3A5等10種亞型。肝臟中不同亞型的CYP450參與大部分內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝。
　　傳統(tǒng)上CYP450酶的個(gè)體差異均指個(gè)體間差異，為藥物代謝、療效和毒性出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。個(gè)體間差異定義為不同個(gè)體間的同一種

2、CYP亞型代謝活性不同，通常可以用于指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的個(gè)體化用藥，已被國內(nèi)外大量研究。
　　個(gè)體內(nèi)差異指同一個(gè)體的不同CYP亞型表現(xiàn)出不同的代謝活性，與個(gè)體間差異相比，個(gè)體內(nèi)差異對個(gè)體化用藥起著同樣重要的作用。然而，現(xiàn)在關(guān)于CYP450酶的個(gè)體內(nèi)差異卻很少被研究者研究。為了更好的實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥，研究和了解CYP450酶活性的個(gè)體內(nèi)差異非常必要。
　　目的：
　　本研究以105例中國人的正常肝臟組織為試驗(yàn)對象，考察了10種

3、主要的CYP亞型（CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5）對特異性底物的相對代謝活性和個(gè)體內(nèi)差異，同時(shí)分析了不同CYP亞型相對代謝活性的相關(guān)性，探討了CYP基因多態(tài)性對個(gè)體內(nèi)差異的影響。期望能夠?yàn)榕R床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1人肝標(biāo)本收集
　　收集肝功能正常的肝標(biāo)本105例，年齡范圍20～75歲。肝組織經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查確認(rèn)無HBV或HCV感染，肝功能正常，并且經(jīng)后

4、期組織病理學(xué)檢查證實(shí)，屬于正常肝臟組織。本試驗(yàn)方案經(jīng)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書。
　　2人肝微粒體制備和蛋白濃度測定
　　人肝微粒體的制備采用差速離心法，肝微粒體蛋白含量的測定采用Bradford法。
　　3人肝微粒體中CYP酶活性的測定
　　CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5的底物分別是非那西汀、香豆素、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奧美拉唑

5、、右美沙芬、氯唑沙宗和咪達(dá)唑侖。摸索各孵育體系中的最佳蛋白濃度和孵育時(shí)間，并最終分別測定105例正常人肝微粒體中10種CYP亞型的酶動力學(xué)參數(shù)(Vmax、Km和CLint)。
　　410種CYP亞型的基因多態(tài)性分析
　　采用DNA提取試劑盒從肝組織中提取基因組DNA。10種CYP亞型中，本試驗(yàn)檢測了在中國人群中發(fā)生頻率大于1％的多態(tài)性位點(diǎn)。
　　5統(tǒng)計(jì)方法
　　采用GraphPad Prism5.0軟件計(jì)算酶動力

6、學(xué)參數(shù)。以每個(gè)個(gè)體每種CYP亞型Km、Vmax和CLint的絕對值除以105例個(gè)體該CYP亞型對應(yīng)參數(shù)的中位數(shù)，即得每個(gè)個(gè)體每種CYP亞型的相對代謝活性（Relative Km、Vmax和CLint）。每個(gè)個(gè)體10種CYP亞型的個(gè)體內(nèi)差異采用個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)(ICV)表示，即每個(gè)個(gè)體10種CYP亞型的相對Km、Vmax或CLint的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以同一個(gè)體10種CYP亞型對應(yīng)Km、Vmax或CLint的平均值。
　　使用SPSS17.0

7、(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)層次聚類分析來計(jì)算10種CYP亞型的相關(guān)性和相似度。
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析10種CYP基因多態(tài)性對相對代謝活性的高低。具體采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和邦費(fèi)羅尼檢測(Bonferroni test)方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1肝微粒體蛋白濃度測定
　　標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=1.

8、5898A-0.0512(R2=0.9939)，105例肝微粒體蛋白濃度中位數(shù)（范圍）為8.39(1.31～11.66)mg·ml-1。
　　2肝微粒體中10種CYP亞型對探針代謝活性的方法學(xué)
　　10種CYP亞型的探針底物及人微粒體中的其他雜質(zhì)均不干擾代謝產(chǎn)物的色譜峰，說明本研究建立的高效液相色譜法專屬性較高。代謝產(chǎn)物的日內(nèi)及日間變異均小于10％，且回收率均在90％～110％之間，精確性和準(zhǔn)確性均較高。本研究建立的分析方法

9、符合生物樣本的測定要求。
　　CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5孵育體系中的最佳蛋白濃度分別為0.3、0.3、0.5、0.5、0.5、0.5、0.3、0.3、0.2mg·ml-1，最佳孵育時(shí)間分別為30、30、60、120、60、90、20、30、5min。
　　3肝微粒體中10種CYP亞型的個(gè)體內(nèi)差異
　　3.1肝微粒體中10種CYP亞型活性的個(gè)體內(nèi)差異
　　10

10、5例正常中國人肝微粒體10種CYP亞型的相對代謝活性不同，同一個(gè)體的10種CYP亞型對代謝探針?biāo)幬锏南鄬Υx活性差異較大。105例個(gè)體相對Vmax Km和CLint的體內(nèi)百分變異系數(shù)分別為44.03％(16.79％～127.42％)、45.88％(18.31％～140.14％)、52.00％(24.20％～134.81％)。
　　3.2肝微粒體中10種CYP亞型的相對代謝活性
　　對相對Vmax、相對Km、相對CLint進(jìn)行

11、排序，其中CYP3A4、CYP2C19和CYP2D6的相對Vmax位居前三名，CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的相對Km位居前三名，CYP2D6、CYP2B6和CYP3A4的相對CLint位居前三名。
　　410種CYP亞型的相關(guān)性
　　對正常人肝微粒體10種CYP亞型的酶動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。發(fā)現(xiàn)CYP2C8與CYP2C9在Vmax間的相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.537，P=3.48E-09)。10種CY

12、P亞型的Km間相關(guān)性較低，僅CYP1A2與CYP2C9的Km間存在較強(qiáng)相關(guān)性(r=0.475，P=3.04E-07)。10種CYP亞型的CLint間相關(guān)性較Vmax低。
　　510種CYP亞型的聚類分析結(jié)果
　　若將10種CYP亞型的相對Vmax聚成兩類，則CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2B6和CYP3A4/5可聚為一類，剩余的聚為另一類。其中CYP2C8和CYP2C9相對Vmax的相關(guān)性最強(qiáng)，相似度也最高

13、。
　　10種CYP亞型的Km聚類分析結(jié)果顯示CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6、CYP2C19、CYP2A6、CYP2C8和CYP2D6可聚為第一類，而CYP2E1和CYP3A4/5聚為第二類。CYP1A2與CYP2C9的相關(guān)性最強(qiáng)、相似度最高。
　　用分層聚類分析的方法對10種CYP亞型的相對CLint進(jìn)行聚類分析，結(jié)果可聚為2類，第一類的成員包括:CYP2C8、CYP2C9、CYP1A2、CYP2B6，第二類的成

14、員包括:CYP2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5。其中CYP2C8和CYP2C9的相對CLint表現(xiàn)出最強(qiáng)的相關(guān)性和最高的相似度。
　　6基因多態(tài)性對CYP酶代謝探針?biāo)幬飩€(gè)體內(nèi)差異的影響
　　分析每組例數(shù)大于7例的基因型對10種CYP亞型代謝活性個(gè)體內(nèi)差異的影響，發(fā)現(xiàn)大部分多態(tài)性對CYP亞型代謝活性的個(gè)體內(nèi)差異無影響。僅發(fā)現(xiàn)CYP2A6*4，CYP2B6785A＞G和CYP2D6100C＞

15、T顯著影響CYP亞型代謝活性的個(gè)體內(nèi)差異。
　　結(jié)論：
　　1.10種CYP亞型的代謝活性在同一個(gè)體內(nèi)存在巨大的個(gè)體內(nèi)差異，相對Km、Vmax和CLint的個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)較大。
　　2.同一個(gè)體的CYP亞型之間存在復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，其中CYP2C9和CYP2C8的相對Vmax和相對CLint的相關(guān)性最強(qiáng)，相似度最高，CYP2C9和CYP1A2的相對Km的相關(guān)性最強(qiáng)，相似度最高。
　　3.CYP2A6*4、CYP2B