肝癌病人肝纖維化組織中CYP450酶代謝活性的改變.pdf

1、肝纖維化（Liver fibrosis, LF）是慢性肝病發(fā)展過(guò)程中常見的一種病理狀態(tài)，其發(fā)生與外在因素（長(zhǎng)期接觸致癌劑黃曲霉素、肝炎病毒的持續(xù)感染、長(zhǎng)期酒精攝?。┮约皟?nèi)在代謝疾病（糖尿病、肥胖）等相關(guān)。疾病早期，機(jī)體表現(xiàn)出對(duì)內(nèi)外刺激的一種炎性損傷修復(fù)反應(yīng)，也就是肝硬化的早期，此過(guò)程是可逆的。當(dāng)刺激長(zhǎng)期持續(xù)性進(jìn)行，肝纖維化程度不斷進(jìn)展形成肝硬化（Hepacullar cirosis）、最后惡化成肝癌(Hepatocellular car

2、cinoma, HCC)。肝臟是人體內(nèi)最大的代謝器官，疾病狀態(tài)下其代謝功能發(fā)生改變。研究肝臟疾病狀態(tài)下CYP酶代謝活性改變的目的是為臨床調(diào)整給藥劑量，給出合理的個(gè)性化用藥意見，從而緩解疾病的發(fā)生發(fā)展。前期我們?cè)谌烁误w外代謝發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞肝癌患者的CYP酶活性與正常人相比發(fā)生改變， CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP3A4/5的活性降低，而 CYP2E1的活性升高。但是，不同疾病狀態(tài)下，CYP酶活

3、性的改變是不同的。目前的研究側(cè)重于直接在肝癌癌組織或者肝硬化組織上進(jìn)行，忽略了從肝纖維化到肝硬化最終到肝癌這一種重要過(guò)程。因此，在肝纖維化狀態(tài)下研究肝臟 CYP酶活性的改變對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的研究具有重要意義。此外，我們通常以每毫克微粒體蛋白的酶活性來(lái)表示CYP酶探針?biāo)幬矬w外代謝的活性，但是所測(cè)得的酶活性結(jié)果與一些文獻(xiàn)報(bào)道的多數(shù)CYP酶在肝病晚期酶活性降低不甚相符，此原因可能是由于我們忽略了我們所取肝臟組織本身的差別，體外研究的目的是為了推

4、測(cè)體內(nèi)的真實(shí)情況，因此，有必要在肝臟水平建立一種酶活性的表示方法，作為對(duì)實(shí)際狀態(tài)下肝臟的真實(shí)反映。由于肝臟的實(shí)際大小重量我們難以獲得，只能以一些報(bào)道中的人體體重等相關(guān)生理數(shù)據(jù)來(lái)推測(cè)，即通過(guò)測(cè)定的每克肝臟中微粒體含量（Microsomal protein per gram of liver, MPPGL），推算得出相應(yīng)肝臟水平酶活性。
　　本課題以78例正常人肝臟組織和53例肝癌病人的肝纖維化組織為研究對(duì)象，共測(cè)定組織中10種主要的

5、CYP酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8C、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1以及CYP3A4/5）對(duì)其探針?biāo)幬锏脑谖⒘ｓw水平的代謝活性；測(cè)定了肝臟中微粒體蛋白濃度以及每克肝臟中微粒體蛋白的含量(MPPGL)；并推算出在肝臟水平10種CYP酶的代謝活性；分析了肝纖維化不同程度以及人口學(xué)因素對(duì)CYP酶活性的影響。通過(guò)本課題研究，以期發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)展進(jìn)程中的纖維化階段CYP酶代謝活性的個(gè)體差異及其影

6、響因素，為日后指導(dǎo)臨床調(diào)整給藥劑量、合理用藥提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.肝臟標(biāo)本的收集
　　本研究所收集的正常人肝臟標(biāo)本為常規(guī)手術(shù)切除的非腫瘤肝臟組織，主要為肝血管瘤、膽結(jié)石和膽囊病變的病人，其肝功能均正常，沒有HBV或者HCV的感染，經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)為正常的肝臟標(biāo)本。
　　所收集的肝纖維化標(biāo)本取自正規(guī)手術(shù)切除的腫瘤外的癌旁組織，伴有 HBV或者HCV感染，該組織均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)具有纖維化病變。該組

7、組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)處理根據(jù)Scheuer分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，按照纖維化程度分為四期即S0-S3期。
　　所有標(biāo)本手術(shù)切除后，經(jīng)一些列標(biāo)準(zhǔn)方法處理，于60分鐘以內(nèi)處理后于液氮中保存?zhèn)溆谩?br>　　2.肝微粒體的制備及MPPGL的測(cè)定
　　采用差速離心法制備人肝微粒體，并且用 Bradford法測(cè)定肝微粒體蛋白濃度。每克肝臟微粒體蛋白含量（MPPGL）采用肝微粒體蛋白濃度×體積/肝標(biāo)本凈重/肝臟回收率計(jì)算得到。
　　3.微粒體水平10種

8、CYP酶對(duì)探針底物代謝活性的測(cè)定
　　10種CYP酶探針底物分別為：CYP1A2探針底物為非那西丁，CYP2A6探針底物為香豆素，CYP2B6探針底物為安非他酮，CYP2C8探針底物為紫杉醇，CYP2C9探針底物為甲苯磺丁脲，CYP2C19探針底物為奧美拉唑，CYP2D6探針底物為右美沙芬，CYP2E1探針底物為氯唑沙宗，CYP3A4/5探針底物為咪達(dá)唑侖；所有代謝產(chǎn)物均采用高效液相色譜（High-performance liqu

9、id chromatography, HPLC）聯(lián)合紫外（UV）或者熒光（FLD）檢測(cè)法；反應(yīng)速度用底物的生物轉(zhuǎn)化程度（TR）表示；GraphPad Prism5.0軟件計(jì)算Km和Vmax,清除率CLM為Vmax與Km的比值。所建立的方法經(jīng)驗(yàn)證均有良好的線性關(guān)系，并且符合生物樣本測(cè)定的要求。
　　4.肝臟水平10種CYP酶對(duì)探針底物代謝活性的推算
　　肝臟水平的清除率（CLL）采用微粒體水平的清除率（CLM）×MPPGL計(jì)算

10、得出；肝臟水平的最大反應(yīng)速率（VmaxL）采用微粒體水平的最大反應(yīng)速率（VmaxM）×MPPGL計(jì)算得出。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graph Pad Prism5.0軟件計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)性的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。
　　結(jié)果：
　　1.肝臟標(biāo)本
　　正常組織中男性27例，女性51例，年齡＞45

11、歲的共51例，≤45歲的共27例，吸煙者15例，不吸煙者63例，飲酒者14例，不飲酒者64例。肝纖維化組中男性45例，女性8例，年齡＞45歲的共42例，≤45歲的共11例，吸煙者27例，不吸煙者26例，飲酒者17例，不飲酒者36例。用藥史為均未使用CYP酶的抑制或者誘導(dǎo)劑。
　　肝纖維化組織的分級(jí)中其中S0=3例，S1=5例，S2=19例，S3=26例。
　　2.每克肝臟的微粒體蛋白含量（MPPGL）
　　正常人肝組共

12、78例，其MPPGL的中位數(shù)為34.0 mg·g-1，范圍為9.9~128 mg·g-1，95％置信區(qū)間為14.2~116.8 mg·g-1。肝纖維化組共53例，其MPPGL的中位數(shù)為28.6 mg·g-1，范圍為7.6~93.6 mg·g-1，95%的置信區(qū)間為9.4~82.2 mg·g-1。在正常人肝中MPPGL相差約13倍，在肝纖維化組中MPPGL相差約12.3倍。肝纖維化組中的MPPGL顯著性低于正常肝臟組織（P<0.01）。<

13、br>　　3.10種CYP酶的代謝活性
　　3.1.肝微粒體水平酶的代謝活性
　　肝微粒體水平的酶活性用CYP酶對(duì)探針?biāo)幬锏那宄蕘?lái)代表，以每毫克肝微粒體蛋白為單位。
　　在正常肝臟組中，CYP酶活性表現(xiàn)出巨大差異。CLM在 CYP2C19和2A6表現(xiàn)出最大差異，差異倍數(shù)分比為166倍和454倍，其余依次為CYP3A4/5>CYP2C8>CYP2B6>CYP2D6>CYP1A2>CYP2E1>CYP2C9，依次倍數(shù)為7

14、3、46、40、33、21、12、5。
　　在肝纖維化組中，CYP酶活性也表現(xiàn)出巨大差異。CLM在CYP2A6和1A2表現(xiàn)出最大差異，差異倍數(shù)分比為284倍和143倍，其余依次為CYP2D6>CYP2C8>CYP2B6> CYP2C9>CYP2C19>CYP3A4/5>CYP2E1，依次倍數(shù)為109、100、56、48、20、6、4。
　　在微粒體水平，與正常對(duì)照組相比，肝纖維化組CLM降低的有CYP1A2、CYP2C8；不

15、變的有CYP2A6、CYP2B6、CYP2C19；升高的有CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5、CYP2E1。與正常對(duì)照組相比，肝纖維化組Vmax降低的有CYP1A2、CYP2C8；不變的有CYP2C19；升高的有CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4/5、CYP2D6。
　　3.2.肝組織水平酶的代謝活性
　　肝組織水平的酶活性用CYP酶對(duì)探針?biāo)幬锏那宄蕘?lái)代表，是根據(jù)肝組織的MPPG

16、L含量，由微粒體水平酶活性計(jì)算得出，其以每克肝臟為單位。
　　在正常肝臟組織中， CYP酶活性表現(xiàn)出巨大差異。CLL在 CYP2B6和CYP2C19表現(xiàn)出最大差異，差異倍數(shù)分比為740倍和110倍，其余依次為CYP3A4/5>CYP2C8>CYP1A2>CYP2A6=CYP2C8>CYP2C9=CYP2E1，依次倍數(shù)為90、66、51、29、29、24、24。
　　在肝纖維化組，CYP酶活性也表現(xiàn)出巨大差異。CLL在CYP2

17、A6和1A2表現(xiàn)出最大差異，差異倍數(shù)分別為2546倍和266倍，其余依次為 CYP2D6>CYP2C8>CYP2B6>CYP2C9>CYP2C19>CYP2E1>CYP3A4/5，依次倍數(shù)為241.5、137、74、49、29、20、14。
　　與正常對(duì)照組相比，肝纖維化組組在肝臟水平CLL降低的有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19；不變的CYP2A6、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5；升高的有C

18、YP2E1。與正常對(duì)照組相比，肝纖維化組Vmax降低的有CYP1A2、CYP2C8；不變的有CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5；升高的有CYP2E1。
　　4.微粒體水平和肝臟水平酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性
　　4.1.10種CYP酶兩種水平的Vmax的相關(guān)性
　　4.1.1.正常肝臟組10種酶兩種水平的Vmax的相關(guān)性
　　采用Spearman檢驗(yàn)對(duì)正常肝臟中10種CYP酶在兩

19、種水平的Vmax進(jìn)行相關(guān)性分析，CYP3A4/5的相關(guān)性最高為R=0.684，CYP2C9的相關(guān)性最低為R=0.330。CYP1A2的相關(guān)性為R=0.667，CYP2A6相關(guān)性為R=0.652，CYP2B6相關(guān)性為R=0.532，CYP2C8相關(guān)性為 R=0.530，CYP2C9相關(guān)性為 R=0.330，CYP2C19相關(guān)性為 R=0.588，CYP2D6相關(guān)性為 R=0.562，CYP2E1相關(guān)性為 R=0.608， CYP3A4/5

20、相關(guān)性為R=0.684。10種酶的Vmax兩種水平的相關(guān)性為P<0.01。
　　4.1.2.肝纖維化組10種酶兩種水平的Vmax的相關(guān)性
　　采用Spearman檢驗(yàn)對(duì)纖維化組10種CYP酶在兩種水平的Vmax進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性最高的為CYP3A4/5其相關(guān)性R=0.781，相關(guān)性最低的為CYP1A2其相關(guān)性為R=0.528。其余的幾種酶的相關(guān)性分別為CYP2A6相關(guān)性R=0.681， CYP2B6相關(guān)性R=0.711，

21、CYP2C8相關(guān)性R=0.589，CYP2C9相關(guān)性R=0.565， CYP2C19相關(guān)性R=0.585，CYP2D6相關(guān)性R=0.671，CYP2E1相關(guān)性R=0.581。10種酶兩種水平的Vmax均具有一定的相關(guān)性，P<0.01。
　　4.2.10種CYP酶在兩種水平的CL的相關(guān)性
　　4.2.1.正常肝臟組10種酶兩種水平的CL的相關(guān)性
　　采用Spearman檢驗(yàn)對(duì)正常組10種CYP酶在兩種水平的CL進(jìn)行相關(guān)性

22、分析，CYP1A2的相關(guān)性為R=0.554，CYP2A6相關(guān)性為R=0.565，CYP2B6相關(guān)性為R=0.642，CYP2C8相關(guān)性為R=0.579，CYP2C9相關(guān)性為R=0.564，CYP2C19相關(guān)性為 R=0.574，CYP2D6相關(guān)性為 R=0.708，CYP2E1相關(guān)性為 R=0.482， CYP3A4/5相關(guān)性為R=0.553。10種酶兩種水平的清除率的相關(guān)性為P<0.01。
　　4.2.2.肝纖維化組10種酶兩種

23、水平的CL的相關(guān)性
　　采用Spearman檢驗(yàn)對(duì)纖維化組10種CYP酶在兩種水平的CL進(jìn)行相關(guān)性分析，CYP1A2的相關(guān)性為R=0.122，CYP2A6相關(guān)性為R=0.138，CYP2B6相關(guān)性為 R=0.073，CYP2C8相關(guān)性為 R=0.103，CYP2C9相關(guān)性為 R=0.138， CYP2C19相關(guān)性為 R=0.046，CYP2D6相關(guān)性為 R=0.087，CYP2E1相關(guān)性為R=0.073，CYP3A4/5相關(guān)性為R

24、=0.121。10種CYP酶清除率在兩種水平上均無(wú)相關(guān)性。
　　采用Spearman檢驗(yàn)對(duì)纖維化組10種CYP酶在兩種水平的CL進(jìn)行相關(guān)性分析，CYP1A2的相關(guān)性為R=0.122，CYP2A6相關(guān)性為R=0.138，CYP2B6相關(guān)性為 R=0.073，CYP2C8相關(guān)性為 R=0.103，CYP2C9相關(guān)性為 R=0.138， CYP2C19相關(guān)性為 R=0.046，CYP2D6相關(guān)性為 R=0.087，CYP2E1相關(guān)性為R

25、=0.073，CYP3A4/5相關(guān)性為R=0.121。10種CYP酶清除率在兩種水平上均無(wú)相關(guān)性。
　　5.肝臟纖維化程度對(duì)酶活性的影響
　　在微粒體水平，CYP1A2的Km和Vmax在S1，S2和S3組都高于正常組，且P<0.01；而CLM三組都低于正常組，S1組P<0.05，S2和S3與正常組相比P<0.01。CYP2A6的Vmax在S2和S3組均明顯高于正常組，P<0.05；Km在S2和S3組同樣明顯高于正常組，P<0

26、.05；CLM在正常組和肝纖維化組沒有顯著差異。CYP2B6的Vmax在S1和S3組明顯高于正常組，P<0.01；Km在S3組明顯高于正常組，P<0.01；CLM在正常組和肝纖維化組沒有影響。CYP2C8在的Vmax在肝纖維化組明顯的低于正常組，Km明顯的高于正常組，CLM明顯的低于正常組，且P<0.01。CYP2C9的Vmax、Km和CLM在正常組和纖維化組沒有明顯的差異。CYP2C19的Vmax和CLM在S3組明顯的低于正常組，P<

27、0.01；而Km在兩組之間沒有變化。CYP2D6的 S3組的 CLM明顯高于正常組，P<0.05；Vmax和Km在正常組和纖維化組之間沒有差異。CYP2E1的Vmax、Km和CLM在S1、S2和S3組都明顯的高于正常組，P<0.01。CYP3A4/5的Vmax、Km在S1、S2和S3組都明顯的高于正常組，P<0.01；CLM沒有差異。
　　6.人口學(xué)因素對(duì)酶活性的影響
　　在正常組織中，微粒體水平CYP1A2的Vmax和CL

28、M在男性中明顯高于女性P<0.05；CYP1A2吸煙者Vmax明顯高于不吸煙者，P<0.05；CYP2C9的Vmax吸煙者明顯的高于不吸煙者，P<0.05；CYP2D6吸煙者清除率明顯高于不吸煙者， P<0.01；CYP2C9飲酒者Vmax和CLM都明顯的高于不飲酒者P<0.01；微粒體水平年齡對(duì)微粒體水平的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒有顯著影響。肝臟水平CYP1A2的Vmax在男性中明顯的高于女性，P<0.05。
　　在肝纖維化組，微粒體水平

29、 CYP2A6的 Km飲酒者明顯低于不飲酒者， P<0.05；CYP2B6的 CLM男性明顯高于女性，P<0.05；年齡和吸煙在微粒體水平對(duì)酶動(dòng)力學(xué)沒有影響。在肝臟水平CYP2B6的CLM男性中明顯的高于女性， P<0.05。
　　結(jié)論：
　　1.人肝MPPGL含量存在較大個(gè)體差異，正常人肝臟MPPGL差異約13倍，纖維化組織MPPGL差異約12.3倍，纖維化組織與正常組相比，MPPGL顯著降低（P<0.01）；