藥物代謝酶CYP450基因熱點(diǎn)突變功能及檢測芯片的研究.pdf

1、細(xì)胞色素氧化酶P450(CYP450)是人體內(nèi)一類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的重要代謝酶，代謝活化許多種藥物、前致癌物、前毒物和致變劑。大約有60％的藥物主要是由依賴CYP450s的代謝作用清除的。在CYP450酶系中，CYP4501～3家族得到了廣泛而深入的研究，其功能和性質(zhì)的研究尤為引人關(guān)注。 第一部分中，針對(duì)CYP2D6基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)C188T和64268C，采用寡核苷酸芯片對(duì)240位健康志愿者基因組DNA標(biāo)本進(jìn)行了

2、分型檢測。將受試者的兩個(gè)位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型分型結(jié)果組合進(jìn)行分析，并且進(jìn)一步對(duì)CYP2D6芯片分型與藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行了闡述和討論。芯片分型結(jié)果表明，CYP2D6ch等位基因在中國人群中出現(xiàn)的頻率相當(dāng)高，C188T和G4268C純合突變型的比例分別達(dá)到了53％和54％，出現(xiàn)相應(yīng)等位基因CYP2D6ch的頻率與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果大體一致，并通過擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序驗(yàn)證了芯片的分型結(jié)果，兩者具有良好的一致性。在中國人

3、群中，CYP2D6酶確實(shí)有突變頻率較高的等位基因存在。 同時(shí)選取同一群體中40位志愿者按照芯片分型結(jié)果分成4組進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)(以酒石酸美托洛爾為探藥)，采用高效液相色譜法檢測了受試者體內(nèi)血藥濃度和藥物代謝產(chǎn)物濃度。不同基因型志愿者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，第2組志愿者(CYP2D6*2H*10W／*2M*IOW)的所有藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與第l組志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比均沒有顯著性差異(P>0．05)。第3組志

4、愿者(CYP2D6*2M*10H)與第1組志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比較，美托洛爾tla延長33．8％，AUC0-32增加了90．3％，；而α一羥基美托洛爾的tl／2延長47．3％，AUCo-32降低了40．8％，C一降低了43．9％。尿中排出的代謝產(chǎn)物降低而原藥則有所增加，CLo、CLform分別為第l組志愿者的46．9％和38％，但T一和Cmax均無明顯變化。第4組志愿者(CYP2D6*2M*10M)與第1組志愿者(CY

5、P2D6*2W*10W)相比較差異更大，美托洛爾ti／2延長93％，AUCo-32增加了149％，Cmax增加了30．8％；而α一羥基美托洛爾的ti／2延長79．1％，AUCo-32降低了62．6％，C一降低了60．2％?？梢钥闯?，藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基因分型結(jié)果預(yù)測的表型變化具有良好的一致性。 第二部分中，依據(jù)中國(或是亞裔)人群具有相對(duì)較高發(fā)生率和突變導(dǎo)致的功能變化已知的原則，選擇了其中CYPlA2，CYP2D6，CYP2

6、C19，CYP2C9和CYP3A4五個(gè)重要基因的8個(gè)多態(tài)性為研究對(duì)象?；诤怂峁滔嚯s交原理，設(shè)計(jì)制備出能同時(shí)檢測不同CYP450多態(tài)性位點(diǎn)的基因分型芯片，并針對(duì)芯片雜交反應(yīng)和雜交前PCR擴(kuò)增兩個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。通過對(duì)PCR組分如Mg2+濃度、引物加入量和上下游濃度比值等條件的優(yōu)化，來建立并完善兩重PCR體系，并在此基礎(chǔ)上成功建立了一個(gè)四重PCR體系；通過對(duì)探針的篩選，比較每組探針的信號(hào)比值獲得了特異性最好的八對(duì)野生型和突變型檢測探針；另外