香豆素類化合物花椒毒酚和補骨脂定在肝微粒體代謝的體外研究.pdf

1、目的：
　　研究發(fā)現(xiàn)，很多天然香豆素類化合物對CYP450酶的活性有影響，以抑制作用為主?；ń范痉雍脱a骨脂定是具有相似藥理學(xué)活性的天然香豆素類化合物，兩者是否對CYP450酶的活性有影響以及在體內(nèi)外的代謝途徑目前未見有報道。在本研究中，擬在對花椒毒酚和補骨脂定特點的理解和先期研究的基礎(chǔ)上，明確花椒毒酚代謝起主要作用的CYP450酶、花椒毒酚代謝的動力學(xué)特征并探討花椒毒酚對CYP450酶活性的影響及其可能機制，從而對該類化合物潛在的

2、毒副作用進行早期預(yù)測提供依據(jù);在不同種屬中鑒定補骨脂定的代謝產(chǎn)物，闡明補骨脂定在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，從而為補骨脂定在體內(nèi)發(fā)揮藥效及毒副作用提供化學(xué)基礎(chǔ)，也為進一步改造補骨脂定的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供依據(jù)，同時也能更好地了解補骨脂定代謝的種屬差異，為補骨脂定動物模型的選擇提供參考。
　　方法：
　　一、花椒毒酚在人肝微粒體中代謝
　　200μL的孵育體系，包括100 mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)，NADPH-再生系統(tǒng)(1 mM

3、NADP+，10mM葡萄糖-6-磷酸，1 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，4mMMgCl2)，肝微粒(0.3 mg/mL)。在整個實驗中，花椒毒酚連續(xù)稀釋到所需濃度，體系中甲醇的終濃度少于1％(v/v)。在37℃預(yù)孵5min后，加入NADP+(1 mM，20此)起始反應(yīng)，孵育30min后，加入200μL冰冷的內(nèi)標甲醇溶液終止反應(yīng)。置于冰板1h，然后在4℃下，20000 g/min離心10min，取上清部分儲存在-40℃，直到進行HPLC

4、分析。對照組是不含NADPH，底物或微粒體的體系，確保花椒毒酚代謝產(chǎn)物的形成是依賴人的肝微粒體和NADPH的。
　　二、利用重組CYP450酶系確定花椒毒酚的代謝酶
　　利用體外重組單酶CYP450酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4)，加入花椒毒酚，測定花椒毒酚代謝產(chǎn)物生成量的變化，確定花椒毒酚的代謝酶，確定代謝酶后，測定在代謝酶的酶促動力學(xué)。
　　三、花椒毒酚對C

5、YP450酶抑制實驗
　　抑制實驗采用由肝微粒體、NADPH-再生系統(tǒng)組成的上述孵育系統(tǒng)，探針底物和花椒毒酚或CYP450酶特異性抑制劑，探針底物的濃度大約等于Km值。酶活性被抑制90％以上的進行動力學(xué)分析;花椒毒酚對CYP1A2和CYP3A4半數(shù)抑制濃度IC50值通過與（0-100μM）各種濃度的花椒毒酚孵育獲得的;Ki值是通過與各種濃度的花椒毒酚和探針底物孵育獲得的。
　　四、花椒毒酚的酶促動力學(xué)研究
　　為了估算

6、花椒毒酚動力學(xué)參數(shù)，確保反應(yīng)時間和微粒體的濃度均在線性區(qū)間內(nèi)，根據(jù)預(yù)實結(jié)果，花椒毒酚(0.25-200μM)分別與混合人微粒體孵育30min。動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax通過米氏方程對實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合求得，并采用用Eadie-Hofstee作圖（速度對速度與底物濃度之比的作圖法）進行驗證，明確代謝是單相還是雙相。
　　五、分子對接實驗
　　本實驗中人CYP1A2（pdb編號:2HI4）和CYP3A4(pdb編號:4K9W)

7、晶體結(jié)構(gòu)從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://rcsb.org.pdb/）中下載。用于對接的配體用分子模擬軟件SYBYL X2.1進行處理，其能量最小化使用外部的Tripos分子力場，蛋白質(zhì)和配體的能量質(zhì)子態(tài)化和能量最小化計算采用分子模擬軟件SYBYLX2.1的默認設(shè)置。利用Gold v5.2對接軟件，在晶體結(jié)構(gòu)中，活性位點被確定為以天然配體為中心，6.0(A)的球形范圍。對接構(gòu)象用打分函數(shù)CHEMPLP進行記分，配體的最佳對接構(gòu)象直觀

8、的用Pymol Molecular Graphics System v1.3作圖表示。
　　六、補骨脂定在不同種屬中代謝產(chǎn)物的鑒定
　　補骨脂定(10μM)在Cyno猴、小型豬、比格犬、SD大鼠、人和兔肝微粒體中孵育30 min，通過HPLC/MS/MS鑒定其代謝產(chǎn)物。液相色譜儀采用WatersAcquity UPLCⅠ-Class體系，色譜柱為iKeyCSH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)，流動相為0.1％甲

9、酸水（色譜級別）(A)，色譜級別乙腈(B)，梯度洗脫，0.0-10.0min（乙腈:30％～50％），10-11 min（乙腈:50％～90％），11-12 min(乙腈:90％)，12-13min（乙腈:90％～30％），以及13-15 min（乙腈:30％）。流速3μL/min，柱溫55℃，進樣體積0.5μL，以局部循環(huán)的方式。質(zhì)譜為Waters SynaptG2-Si。
　　結(jié)果：
　　一、花椒毒酚代謝產(chǎn)物的分析

10、>　　在花椒毒酚(10μM)與HLMs和NADPH再生系統(tǒng)孵育30min，生成的產(chǎn)物M，保留時間為3.7min，在沒有NADPH、或沒有底物、或沒有微粒體的陰性對照組中沒有觀察到產(chǎn)物M。
　　二、確定花椒毒酚代謝的CYP450酶亞型
　　采用重組人P450單酶，包括CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19和CYP1A2。結(jié)果顯示花椒毒酚的代謝產(chǎn)物(M)主要是由同工酶CYP1A2催化產(chǎn)生，如果將C

11、YP1A2的催化量標準化成100％的話，其它同工酶的貢獻率分別是CYP3A4(4.5％)、CYP2D6(0％)、CYP2E1(7.3％)、CYP2C9(13.5％)及CYP2C19(3.6％)。
　　三、花椒毒酚對CYP3A4和CYP1A2酶的抑制作用
　　所有CYP450酶陽性對照抑制劑明顯抑制相應(yīng)的CYP450特異性底物的代謝反應(yīng)，剩余活性不超過20％。而花椒毒酚(100μM)對CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2、

12、CYP2A6、CYP2D6、CYP2C8、CYP2C19和CYP2E1酶活性的抑制作用，其酶剩余活性分別是3.3、35.9、9.5、82.1、72.4、52.1、68.3和25.9％。此外，測定了花椒毒酚對CYP1A2和CYP3A4酶抑制的動力學(xué)參數(shù)，花椒毒酚抑制非那西汀O-脫乙基(CYP1A2)和睪酮6β-羥基化(CYP3A4)，其抑制呈濃度依賴性。花椒毒酚對CYP1A2和CYP3A4的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為（27.82±1.3

13、5）μM和（7.43±0.65）μM。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法和Dixon作圖顯示花椒毒酚對CYP1A2和CYP3A4的抑制是非競爭性抑制，其Ki值分別是（21.15±0.80）μM和（2.22±0.31）μM。
　　四、花椒毒酚的代謝動力學(xué)特征
　　在整個實驗的濃度范圍內(nèi)，花椒毒酚的代謝符合典型的米氏動力學(xué)，反應(yīng)速度呈現(xiàn)濃度依賴特征，并通過Eadie-Hofstee作圖驗證。利用Origin軟件，通過

14、非線性回歸計算獲得Vmax和Km值分別是（0.55±0.05）nmol·min-1·mg-1蛋白和（8.46±0.76）μM，固有清除(CLint)是（0.06±0.02）mL· min-1·mg-1蛋白。
　　利用花椒毒酚在人肝微粒體代謝的動力學(xué)參數(shù)，計算出肝臟清除率CLH是（15.91±0.32）mL·min-1·kg-1體重。CLH比肝血流量(QH)的百分比是76.8％。
　　五、分子對接研究
　　花椒毒酚與CY

15、P1A2 ILE（異亮氨酸）117之間存在疏水作用，另外花椒毒酚的苯環(huán)與CYP1A2的PHE（苯丙氨酸）125，PHE（苯丙氨酸）226及PHE（苯丙氨酸）260之間有π-π堆積作用?；ń范痉优cCYP3A4對接的結(jié)果顯示，花椒毒酚與CYP3A4通過氫鍵與ARG（精氨酸）105結(jié)合，以及通過疏水作用與ILE（異亮氨酸）369和LEU（亮氨酸）373結(jié)合。
　　六、補骨脂定代謝產(chǎn)物的確定
　　為了探尋補骨脂定在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及其

16、代謝途徑的總體輪廓，本章采用UHPLC/Q-TOF MS技術(shù)，將MSE數(shù)據(jù)采集模式與MetabolynxTM軟件的質(zhì)量虧損過濾(DMF)技術(shù)結(jié)合，對補骨脂定在人，Cyno猴小型豬，兔，比格犬及SD大鼠肝微粒體中孵育結(jié)果進行分析和鑒定，以期為補骨脂定在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化和發(fā)揮藥效提供實驗依據(jù)。在各個種屬中共檢測代謝產(chǎn)物共11個。
　　結(jié)論：
　　1、花椒毒酚在人肝微粒體中代謝是CYP450s催化的。
　　2、花椒毒酚代謝產(chǎn)物的

17、形成主要由同工酶CYP1A2催化，而其它同工酶對花椒毒酚代謝的貢獻是有限的。
　　3、花椒毒酚對CYP1A2和CYP3A4酶有很強的抑制作用，抑制形式是非競爭性抑制。因此，花椒毒酚與通過CYP3A4或CYP1A2代謝的藥物共同使用的時候，可能產(chǎn)生以基于代謝的藥物-藥物相互作用。
　　4、花椒毒酚的代謝服從典型的米氏動力學(xué)，其代謝由一種CYP450同工酶或兩種Km值相同的CYP450同工酶催化的。根據(jù)花椒毒酚的肝臟清除率推測，