成人散發(fā)性難治性腎病差異基因的篩選.pdf

1、目的:篩選及分析成人散發(fā)性難治性腎病(RNS)、激素敏感性腎病綜合征(SSNS)及正常人間差異表達片段,獲取RNS激素耐藥相關基因,為認識和闡明原發(fā)性腎病綜合征(PNS)患者激素耐藥的分子機制奠定基礎。
　　 方法:(1)選擇成人散發(fā)性RNS患者4例(R1～4)、SSNS患者4例(S1～4)為實驗組,正常人2例(H1～2)為對照組,提取患者靜脈血中總RNA。利用差異顯示PCR技術(DDRT-PCR),擴增總RNA基因表達譜。采用

2、瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產(chǎn)物；變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)高壓電泳進一步分離PCR產(chǎn)物條帶,硝酸銀染色顯示電泳條帶；回收RNS患者、SSNS患者及正常人間差異表達片段,重擴增并純化差異表達片段后送生物公司測序。所得序列在基因庫(Genbank)中通過BLAST軟件與人類基因已知序列進行同源性比較。用所有樣本的RNA為模板進行RT-PCR特異性擴增,驗證差異片段假陽性和假陰性。(2)RT-PCR驗證MAML2基因的表達。另外選擇RN

3、S患者14例(R1’～14)、SSNS患者26例(S1’～26)為實驗組、正常人8例(H1’～8)為對照組,提取各組患者靜脈血中總RNA。采用RT-PCR以所有樣本RNA為模板分組進行特異性擴增,觀察各組MAML2表達是否有差異。結果:(1)成功篩選出成人RNS患者、SSNS患者及正常人間差異表達片段,獲得1個在RNS患者高表達的差異片段R31,1個在SSNS患者高表達的差異片段S34,與Genbank已知序列同源比較結果:片段R31與

4、一個功能不明確的人已知基因部分序列高度同源；片段S34與人MAML2基因部分序列高度同源。RT-PCR證實篩選出的差異片段在對應患者全血總RNA中均有表達。(2)MAML2在正常對照組未見表達,在SSNS組表達高于RNS組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論:(1)mRNA差異顯示技術是一種簡單易行的篩選差異基因的技術。(2)RNS、SSNS患者及正常人間存在較明顯的差異基因。本實驗僅篩選出小部分差異片段。(3)篩選出的在SSNS患