成人散發(fā)性難治性腎病差異基因篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：（1）篩選成人散發(fā)性難治性腎?。≧NS）和激素敏感性腎病綜合征（SSNS）患者間差異表達(dá)片段，獲取與RNS激素耐藥相關(guān)的基因，為認(rèn)識(shí)和闡明原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患者激素耐藥的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。（2）進(jìn)一步探索mRNA差異顯示技術(shù)的方法要點(diǎn)。 方法：（1）以成人散發(fā)性RNS患者6例（R1-6）為實(shí)驗(yàn)組，SSNS患者4例（S1-4）為對(duì)照組。采用密度梯度離心法分離患者外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。（2）利用mRNA差異

2、顯示技術(shù)，采用降落PCR擴(kuò)增PBMC總RNA基因表達(dá)譜。（3）采用1．5%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)PCR產(chǎn)物；6%變性聚丙烯酰胺凝膠高壓電泳進(jìn)一步分離PCR產(chǎn)物條帶，硝酸銀染色顯示電泳條帶；回收RNS與SSNS患者間差異表達(dá)片段，重?cái)U(kuò)增并純化差異表達(dá)片段后送生物公司測(cè)序。（4）所得序列在基因庫(kù)（Genbank）通過(guò)BLAST軟件與人類基因組已知序列進(jìn)行同源比較。（5）用篩選出差異片段對(duì)應(yīng)患者的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR特異性擴(kuò)增，驗(yàn)證差

3、異片段假陽(yáng)性。 結(jié)果：（1）成功篩選出成人散發(fā)性RNS和SSNS患者間差異表達(dá)片段。（2）降落PCR能高效快速的進(jìn)行PBMC基因表達(dá)譜、回收的差異片段及差異片段特異性驗(yàn)證的擴(kuò)增。（3）獲得6條在RNS患者高表達(dá)的片段：R1患者高表達(dá)片段R11、R12，R2患者高表達(dá)片段R21、R22，R6患者高表達(dá)片段R61、R62。（4）R11、R12片段與兩個(gè)功能不明確的已知基因部分片段高度同源：R21片段與MACROD2基因部分片段高度同

4、源；R61片段與MAML2基因部分片段高度同源；R22和R62片段檢索結(jié)果相同，均與Nck2基因、TCP1基因部分片段高度同源。（5）篩選出的差異片段在對(duì)應(yīng)患者PBMC總RNA中均有表達(dá)。 結(jié)論：（1）mRNA差異顯示技術(shù)與降落PCR方法結(jié)合是一種簡(jiǎn)單易行的篩選RNS和SSNS患者間差異片段的技術(shù)，為成人散發(fā)性RNS、SSNS患者間差異基因的篩選提供高效、快速、可靠的手段。（2）成人散發(fā)性RNS和SSNS患者間存在明顯的差異表達(dá)