第一鰓弓外胚間充質細胞牙向分化差異基因的初步篩選.pdf

1、最新的發(fā)育生物學研究證實，在顱神經嵴細胞分化形成牙頜骨器官的過程中，先后經歷了顱神經嵴→第一鰓弓外胚間充質→牙頜骨外胚間充質兩次關鍵性級聯(lián)分化。本研究旨在建立Balb/c胎小鼠第一鰓弓外胚間充質細胞體外培養(yǎng)模型，在此基礎上，進行多向誘導分化研究，鑒定其干細胞生物學特性。同時，構建第一鰓弓外胚間充質細胞牙向分化雙向抑制消減文庫，初步篩選、驗證、分析差異表達基因，為全面揭示牙發(fā)生、發(fā)育的分子調控機制提供理論依據(jù)。 首先，精確解剖分離

2、孕9.5天(E9.5)Balb/c胎鼠第一鰓弓，采用組織塊法和改良酶消化法對其進行原代培養(yǎng)，利用反復貼壁和多次差異消化法對其進行純化，通過細胞形態(tài)觀察、細胞生長曲線描記、計算細胞倍增時間和特異性標記物檢測對其細胞生物學特性進行研究。其次，利用端粒酶原位雜交熒光探針和Brdu攝取實驗，檢測第一鰓弓外胚間充質細胞的增殖和自我更新能力；取第3代細胞，更換不同的條件培養(yǎng)液，觀察其在成脂、成內皮和礦化誘導液的刺激下，細胞形態(tài)學變化，并檢測鑒定相應

3、的特異性細胞表型標記，對細胞的可塑性進行研究。然后，在相同的培養(yǎng)條件下，收取第3代第一鰓弓外胚間充質細胞和E16.5下頜第一磨牙牙乳頭細胞，采用抑制消減雜交技術，構建雙向抑制消減文庫，并對細胞的總RNA質量、雙鏈cDNA酶切效果、接頭連接率、抑制消減效率、差異基因的富集程度和載體連接效率進行全面質控分析。最后，在雙向抑制消減文庫中隨機挑取23個白色克隆，測定其核苷酸序列，利用生物信息學數(shù)據(jù)庫，對差異表達片段進行同源性分析比較，尋找已知基

4、因和未知新基因，分析其相關功能研究進展；解剖分離E9.5、E12.5、E14.5和E16.5胎鼠的第一鰓弓、下頜突和下頜第一磨牙牙乳頭，利用實時熒光定量PCR技術，定量分析部分差異表達基因在四個時段組織學水平的相對變化趨勢。 研究結果表明：E9.5胎鼠額鼻突、第一鰓弓、第二鰓弓均界限清楚明確，便于準確取材，組織塊法原代培養(yǎng)細胞的時間約7～10天，上皮細胞成分較多，改良酶消化法原代培養(yǎng)細胞時間約2～3天，上皮細胞成分較少，兩組細胞

5、傳代后細胞形態(tài)、細胞生長曲線、群體倍增時間無明顯差異，但采用改良酶消化法可以在短時間內獲得數(shù)量充足、純度較高的滿足實驗要求的細胞。特異性標記物CD57/HNK1、波形絲蛋白免疫細胞化學染色呈均一表達。第一鰓弓外胚間充質細胞端粒酶原位雜交胞漿呈陽性反應，BrdU孵育48小時，大部分細胞胞核呈陽性反應。第3代外胚間充質細胞在成脂誘導1周左右，細胞內可見連接成片的發(fā)亮的空泡，油紅O染色陽性，證實空泡為脂滴，RT-PCR產物凝膠電泳顯示，誘導后

6、細胞出現(xiàn)了脂蛋白脂肪酶的表達。成內皮誘導10天左右，出現(xiàn)了內皮細胞特有的鋪路石樣形態(tài)，馮威勒不蘭特因子免疫細胞化學染色呈強陽性。礦化誘導1周后，Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色呈陽性反應，堿性磷酸酶染色大部分細胞呈陽性反應，礦化誘導2周后，茜素紅染色顯示細胞間出現(xiàn)致密的、圓形不透光團塊，呈片狀紅染。以第一鰓弓外胚間充質細胞為檢測子，建立的正向抑制消減文庫中共有184個白色克隆，以其為驅趕子建立的反向文庫中，共有132個白色克隆，通過多層次質控分

7、析證實，消減文庫質量可靠。對23個克隆進行測序分析后發(fā)現(xiàn)有1個是空載體，去除重復序列，對15個差異片段進行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)有11個片段與小鼠已知基因高度同源，另有4個片段為染色體序列，可能為新基因。7個差異基因的實時熒光定量PCR結果與抑制消減雜交技術所獲結論完全一致，其中克隆1-3倍比變化非常明顯，進一步證明了其可能是一條新基因的推斷。 綜上所述，本研究首次在體外建立了E9.5胎鼠第一鰓弓外胚間充質細胞培養(yǎng)模型，所培養(yǎng)第一鰓