馴鹿茸頂端間充質(zhì)組織雌雄差異表達(dá)基因的初步篩選.pdf

1、鹿茸是哺乳動(dòng)物中唯一能夠再生的組織器官，因此其為研究動(dòng)物組織器官再生提供了獨(dú)特模型。鹿茸生長中心細(xì)胞增殖生長速度是癌細(xì)胞的30多倍，并且沒有發(fā)現(xiàn)任何癌變的跡象，了解其分子調(diào)控機(jī)制為研究癌癥提供新的目標(biāo)和方向。馴鹿是鹿科動(dòng)物中唯一雌雄都長角的物種，但其雌雄鹿茸角的差異較大，脫角的時(shí)間不同，研究馴鹿茸雌雄差異表達(dá)基因更容易弄清楚鹿茸再生和生長發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制。
　　本試驗(yàn)采用鹿茸增殖、生長最快的頂端間充質(zhì)組織為研究對象，Trizol法

2、提取組織總RNA，利用mRNA差異顯示PCR技術(shù)初步篩選馴鹿茸雌雄差異表達(dá)基因片段，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、二次擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠回收、產(chǎn)物克隆測序檢測其假陽性，最后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定結(jié)果。試驗(yàn)采用3條錨定引物(A、B、C)和10條隨機(jī)引物(a、b、c、d、e、f、g、h、i、j)共30對引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，共篩選獲得52條差異片段，回收了7條，經(jīng)測序BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)5條(Ae1

3、、Af1、Af3、Ce1、Ci2)與已知基因序列高度同源，片段大小均在100-400bp之間。其中Ae1與牛的原肌球蛋白-4(TPM4)同源性較高(99％)，原肌球蛋白參與調(diào)節(jié)肌肉收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)，原肌球蛋白的表達(dá)量下調(diào)或與癌癥發(fā)生有關(guān);Af1與牛的SMAD5基因同源性較高(94％)，SMAD5是與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白，有促進(jìn)成骨的作用;Af3與牛的HMGB1基因同源性較高(98％)，HMGB1起到

4、穩(wěn)定細(xì)胞核，協(xié)助轉(zhuǎn)錄的作用，分泌到細(xì)胞外可能跟腫瘤的發(fā)生有關(guān);Ce1與藏羚羊的Ⅵ型膠原蛋白α3肽鏈(COL6A3)同源性較高(98％)，Ⅵ型膠原蛋白是構(gòu)成骨骼和肌肉的主要成分;Ci2與綿羊的SLC17A5基因同源性較高(92％)，SLC17A5表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sialin起到在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)游離唾液酸的作用。
　　本試驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn):Ae1、Af3在雄性馴鹿茸頂端間充質(zhì)層表達(dá)量大于雌性，Af1、Ce1、Ci2在雌性馴鹿茸頂端間充質(zhì)層表