GHR、IGF-1、IGF-1R基因在鹿茸頂端的組織定位及鹿GHR基因cDNA克隆.pdf

1、目的：通過在鹿茸頂端對生長激素受體(GHR)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、胰島素樣生長因子l受體(IGF-1R)基因的組織定位以及GHR基因cDNA的克隆初步闡明這些生長因子的分泌機(jī)制及對鹿茸生長的調(diào)節(jié)作用。在鹿茸生長過程中生長激素(GH)控制著IGF-1的水平，而IGF-1則直接作用于靶細(xì)胞，介導(dǎo)GH的生物效應(yīng)。GH首先與細(xì)胞表面特異性受體(GHR)結(jié)合形成配體受體復(fù)合物，再由受體介導(dǎo)激發(fā)一系列生化反應(yīng)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。由此

2、揭示鹿茸快速生長整個(gè)階段中一些生長因子對其生長的調(diào)節(jié)規(guī)律，為進(jìn)一步研究鹿茸快速生長提供一定的數(shù)據(jù)與方法。 方法：(1)設(shè)計(jì)引物，以鹿茸頂部提取的總。RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)克隆GHR基因的cDNA，得到克隆片段后回收測序進(jìn)行同源性比對。(2)提取鹿的DNA，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增GHR、IGF-1、IGF-1R基因，純化后連接啟動(dòng)子，以T7轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并標(biāo)記，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為探針。(3)制作冰凍切片，用原位雜交技術(shù)對鹿茸頂端GH

3、R、IGF-1、IGF-1R基因的表達(dá)進(jìn)行組織定位。(4)以鹿茸頂部不同層提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板分別對GHR、IGF-1基因擴(kuò)增，用半定量PCR方法分析他們在各組織層的表達(dá)水平。 結(jié)果：(1)克隆得到了GHR基因的cDNA序列(Genbank登陸號為EU381142)，序列全長為1967bp，包括該基因的全部編碼序列。GHR蛋白的前體為634個(gè)氨基酸序列，對其序列進(jìn)行分析與對比，鹿GHR基因與牛、羊和人類GHR核苷酸同

4、源性分別為97％，97％和80％，GHR蛋白氨基酸序列同源性分別為97.9％、97.6％和77.3％。(2)對GHR、IGF-1、IGF-1R基因的探針分別標(biāo)記，純化，檢測探針的濃度，能夠達(dá)到原位雜交實(shí)驗(yàn)所要求的濃度。(3)GHR、 IGF-1、IGF-1R基因原位雜交結(jié)果顯示了陽性信號，進(jìn)一步表明了鹿茸頂端存在這三個(gè)基因的表達(dá)。(4)在鹿茸頂端的皮膚層、間葉細(xì)胞和軟骨膜層、軟骨區(qū)用半定量PCR(RT-PCR)的方法對GHR、IGF-1