殼聚糖轉(zhuǎn)染igf-1基因?qū)浌菗p傷的修復(fù).pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)是一個(gè)由70個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量為7649Da。其生物學(xué)功能主要有類胰島素的代謝調(diào)節(jié)作用及促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖的促生長(zhǎng)作用。IGF-1對(duì)生長(zhǎng)遲滯、糖尿病、骨質(zhì)疏松、軟骨損傷等疾病具有治療作用，有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但是同時(shí)也暴露出了其體內(nèi)半衰期短，全身給藥副作用大等缺點(diǎn)。IGF-1的基因治療，特別是局部轉(zhuǎn)基因治療為IGF-1的臨床應(yīng)用提供了一種新的給藥方式，近來(lái)備受關(guān)注。本文以殼聚糖(chito

2、san，CS)做為基因轉(zhuǎn)移載體，進(jìn)行了局部轉(zhuǎn)igf-1基因治療軟骨損傷的研究。 體外實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建了含IGF-1信號(hào)肽及成熟肽全部編碼序列的重組報(bào)告基因載體pTracer-igf-1。將此重組質(zhì)粒與殼聚糖制成pTracer-igf-1/CS復(fù)合物轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的C2C12小鼠成肌細(xì)胞系。以抗生素Blasticidin篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，3H-TdR摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果示，CS可有效的將pTracer-igf-1質(zhì)粒DNA遞

3、送入C2C12細(xì)胞；較未轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有igf-1基因細(xì)胞的增殖速率明顯增加；同時(shí)，所收集的轉(zhuǎn)igf-1基因細(xì)胞的培養(yǎng)基也可顯著促進(jìn)空白C2C12細(xì)胞的增殖。表明受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠有效地合成并分泌IGF-1，分泌到細(xì)胞外的IGF-1可發(fā)揮促細(xì)胞增殖的作用。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以手術(shù)方式復(fù)制了兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷動(dòng)物模型，分別向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射CS溶液、pTracer-igf-1/CS納米粒及生理鹽水，每72小時(shí)給藥一次。28天后處死

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，收集損傷部位及周邊軟骨組織標(biāo)本用于以下檢測(cè)。(1)提取軟骨細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)Aggrecan、CollagenII這兩個(gè)軟骨損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)水平。(2)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)水平。(3)組織形態(tài)HE、甲苯胺藍(lán)染色反映軟骨組織中蛋白聚糖沉積情況。結(jié)果如下，(1)基因表達(dá)水平：pTracer-igf-1/CS復(fù)合物干預(yù)可以最為顯著的提高Aggrecan及Collage

5、nII基因表達(dá)水平。(2)組織形態(tài)學(xué)：關(guān)節(jié)腔注射pTracer-igf-1/CS復(fù)合物組及殼聚糖組出現(xiàn)了不同程度的軟骨增生性修復(fù)，轉(zhuǎn)基因組明顯優(yōu)于殼聚糖組，新生軟骨具有正常軟骨細(xì)胞的功能；其他組主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞性修復(fù)。(3)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：pTracer-igf-1/CS復(fù)合物組軟骨損傷部位出現(xiàn)大量新生軟骨組織，新生軟骨細(xì)胞較幼稚，增生軟骨細(xì)胞及其基質(zhì)中可檢測(cè)到被染成棕黃色的S-100蛋白，且分布不均：其它組未見明顯新生