TGF-β1基因轉染BMSCs復合蠶絲蛋白-殼聚糖支架構建功能軟骨的研究.pdf

1、目的:骨關節(jié)炎（Osteoarthritis）是嚴重影響人類生活的疾病之一，由于關節(jié)軟骨內缺乏血液供應，一旦損傷，自我修復能力極差，而且病情會隨著時間逐步進展。隨著我國乃至全球老年人口的增加，骨關節(jié)炎發(fā)病率處于上升趨勢，同時骨關節(jié)疾病開始趨于年輕化，而且人數(shù)還在不斷增加。目前關節(jié)軟骨缺損的治療方法雖然給軟骨缺損修復帶來了新希望，但是仍存在不足之處，主要包括需要從供區(qū)取出骨、軟骨組織或在正常組織上鉆孔，給供區(qū)造成新的損傷，而且需要至少2次

2、以上的手術，同時由于供體來源有限，不能完全滿足臨床需求，因此，尋求一種替代骨軟骨移植物是急需解決的問題。本工作在文獻報道和前期研究的基礎上，以殼聚糖和蠶絲蛋白為原材料通過冷凍干燥法來制作支架，然后將TGF-β1質粒DNA轉染的BMSCs作為種子細胞種植在支架上構建組織工程化培養(yǎng)模型，并自行分泌生長因子，通過自分泌和旁分泌作用，在微環(huán)境下誘導BMSCs向軟骨細胞分化。研究結果對修復骨軟骨缺損有重大的意義，也為治療骨關節(jié)炎提供一定的臨床參考

3、。因此，研究工作對于相關骨軟骨疾病的治療與康復進行了有意義的探索。
　　方法:
　　1采用密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，并對所獲得的細胞進行體外培養(yǎng)及鑒定。研究骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)方法，了解其一般生物學特性，為進一步研究打下基礎。
　　2蠶絲蛋白-殼聚糖組織工程支架的制備:蠶絲蛋白與殼聚糖按不同比例制備三種蠶絲蛋白-殼聚糖支架，對制備的支架進行傅里葉紅外光譜結構分析;考察復合支架的密度、孔隙率、熱水溶失率、力

4、學性能、吸水膨脹率、抑菌能力等理化性質;支架接種細胞后用MTS法考察細胞在支架上培養(yǎng)1、3、5、7d的增殖情況;SEM掃描電鏡觀察各組支架的孔徑大小、形態(tài)及細胞在最優(yōu)支架上培養(yǎng)2、5d的黏附情況;HE染色觀察細胞在最優(yōu)支架上培養(yǎng)5、10d的形態(tài)及滲透生長情況。
　　3基因轉染及鑒定:取TGF-β1質粒及其空載體質粒轉化感受態(tài)細胞涂板，并挑單克隆，用LB培養(yǎng)基擴增，小量提取質粒、測序。通過脂質體法將獲得的TGF-β1質粒及其空載體質

5、粒轉染第三代BMSCs:具體操作步驟按照脂質體lipofection2000說明書進行。轉染48h后行逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測TGF-β1mRNA表達水平。
　　4組織工程化培養(yǎng)模型的建立:用0.25％胰酶消化轉染TGF-β1質粒、轉染空載體質粒48h后的第三代BMSCs及空白對照組的第三代BMSCs，含10％胎牛血清的

6、LG-DMEM培養(yǎng)基終止消化，重懸細胞，計數(shù)，以2×106/mL接種到支架上，每塊支架接種約20μL細胞懸液，構建組織工程化培養(yǎng)模型。實驗共分三組:A組（TGF-β1質粒轉染組）、B組（空載體質粒轉染組）和C組（空白對照組）。
　　5組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別行酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA)法檢測培養(yǎng)液上清中TGF-β1蛋白的含量。
　

7、　6組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別利用阿利新藍法測定培養(yǎng)液上清中酸性糖胺多糖的含量。
　　7組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)2周后行逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測支架細胞復合體中Ⅱ型膠原、Sox9 mRNA的表達水平。
　　結果:
　　1采用密度梯度離心法可以成功分離大鼠BMSCs，可見原代細胞剛接種

8、時散在分布，呈圓形，24h后有部分細胞貼壁。貼壁細胞呈長梭形或多角形，第3-7d，細胞融合生長，呈梭形且呈集落樣增殖，7-10d可以達到80-90％融合，傳代后細胞生長明顯加速，生長活躍，并呈典型的漩渦樣生長。隨著傳代次數(shù)的增加，可得到高純度的BMSCs。經(jīng)3次傳代后，細胞形態(tài)較為一致。
　　2取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，經(jīng)過成軟骨、成骨誘導液誘導后，分別采用天狼猩紅染色、甲苯胺藍染色、ALP染色及茜素紅染色來鑒定誘導后軟骨

9、細胞、成骨細胞表型。結果證實本實驗采用密度梯度離心法提取的BMSCs具有多向分化潛能。
　　3傅里葉紅外光譜證明:殼聚糖由糖特征結構β-1，4糖苷鍵相互連接而成，故各組在1154 cm-1及897 cm-1處出現(xiàn)了特征性吸收峰，對于CS-SF支架材料來說，隨著CS含量的增高，代表無規(guī)卷曲/α螺旋結構的吸收峰1654 cm-1和1540cm-1不斷減小，而對應于1628 cm-1和1516 cm-1處相當于β-折疊結構的吸收峰不斷增

10、大，表明CS的加入改性了SF的結構，使α螺旋結構/無規(guī)卷曲向β-折疊結構轉變;各組密度分別為0.18±0.03，0.20±0.01，0.18±0.04(g/ml);孔隙率分別為87.36±2.15，77.82±1.37，72.22±1.37(％);熱水溶失率分別為:0，0，3.12±1.26(％);彈性模量分別為:8.35±2.64，15.50±1.64，12.55±3.37(KPa);吸水膨脹率分別為:1528.52±194.63，1

11、078.22±100.52，1320.05±179.97(％);抑菌圈直徑分別為:18±1，22±2，20.33±1.53(mm); SEM下觀察1組支架孔徑在50-250μm之間，孔徑大小較為一致，孔相通性好，其它兩組結構紊亂，孔徑大小不一，孔相通性差;生長曲線結果示:1d時1組中活細胞數(shù)明顯高于2組(P＜0.01)，3d、5d和7d時，1組中活細胞數(shù)量明顯高于2組和3組(P＜0.01); SEM可見細胞呈梭形黏附于支架上，隨著培養(yǎng)天

12、數(shù)的增加周圍出現(xiàn)較多量細胞外基質;HE染色發(fā)現(xiàn)BMSCs在培養(yǎng)初期沿著支架材料內部空隙貼壁生長，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，貼壁細胞呈集落樣生長，可明顯看到細胞間連接;結果證實:CS-SF支架的細胞相容性良好，能促進BMSCs的存活和黏附，可以為細胞提供一個開放的生長環(huán)境，促進細胞向支架內部生長，并保證足夠的營養(yǎng)和氣體交換。
　　4脂質體介導的TGF-β1質粒及其空載體質粒瞬時轉染大鼠第三代BMSCs，轉染48h后行逆轉錄聚合酶鏈式反應(

13、reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)檢測TGF-β1 mRNA的表達水平。RT-PCR結果表明A組TGF-β1 mRNA的表達水平高于B組和C組(P＜0.01)。
　　5組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別行酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA)法檢測培養(yǎng)液上清中TGF-β1蛋白的含量，結

14、果顯示:四個時點，A組的TGF-β1分泌量都高于B組和C組(P＜0.05)，同時A組TGF-β1單日分泌量呈逐漸下降趨勢，B組和C組TGF-β1單日分泌量則始終呈低表達趨勢。
　　6組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別利用阿利新藍法測定培養(yǎng)液上清中酸性糖胺多糖的含量。結果顯示:3、6、12d三個時點，A組培養(yǎng)液上清中GAG含量明顯高于B組和C組(P＜0.01)。同時A組GAG單日分泌量呈逐漸上升趨勢，B組和C組GAG

15、單日分泌量則始終呈低表達趨勢。證實A組細胞出現(xiàn)成軟骨分化趨勢。
　　7組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)2周后提取總RNA，行逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測支架細胞復合體中Ⅱ型膠原、Sox9 mRNA的表達水平。結果顯示:A組表達Ⅱ型膠原、Sox9 mRNA，B組和C組則無Ⅱ型膠原和Sox9兩種軟骨細胞特異性標志基因的表達。
　

16、　結論:
　　1密度梯度離心法可以成功分離大鼠BMSCs，所分離的BMSCs具有多向分化潛能。
　　2蠶絲蛋白和殼聚糖均為天然生物材料，原料易得，生物相容性好，本研究將蠶絲蛋白與殼聚糖復合，通過強烈的氫鍵和離子鍵作用，改善其理化性能，并開發(fā)出適合于軟骨組織工程領域的蠶絲蛋白-殼聚糖復合支架材料。
　　3脂質體法成功將TGF-β1基因真核表達型質粒及其空載體質粒轉染到生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，然后將轉染48h后的第