泰安地區(qū)慢性感染HBV RT區(qū)耐藥性分子變異及其體外表達(dá).pdf

1、目的：通過對(duì)臨診乙型肝炎病毒(Hepatisis B Virus，HBV)感染陽性患者所攜帶HBV基因組DNA(Genomic DNA，gDNA)的反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase，RT)區(qū)進(jìn)行調(diào)查，以期發(fā)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)有義變異位點(diǎn)，從而推斷其變異與抗HBV藥物的相關(guān)性，為發(fā)現(xiàn)HBV新的耐藥位點(diǎn)及臨床抗HBV用藥提供新的素材和理論參考；選取典型變異樣本的HBV gDNA，構(gòu)建其RT活性區(qū)的重組克隆，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并經(jīng)間接免疫

2、熒光(indirect immunofluorescence assay，IFA)檢測其表達(dá)活性，為構(gòu)建其永久表達(dá)細(xì)胞系做準(zhǔn)備，同時(shí)為研究HBV變異與耐藥性奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴選取從2011年4月至2011年12月在泰安八十八醫(yī)院用核苷(酸)類藥物治療的慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)大三陽患者，取其全血并分離血清，-80℃標(biāo)記凍存。⑵采用BIOMIGA公司血液基因組DNA提取試劑盒從保存的血

3、清中分離、純化HBV gDNA。⑶取經(jīng)PCR擴(kuò)增HBV S基因片段為陽性的核酸樣本，用互為重疊的兩對(duì)引物經(jīng)PCR分兩段擴(kuò)增HBV DNA全長基因(分為f1、f2兩部分)。⑷將擴(kuò)增出的f1、f2片段PCR產(chǎn)物分別與原核載體pMD18 T vecter連接，分別命名為T-f1、T-f2，在固體培養(yǎng)皿上長出的優(yōu)勢抗性菌落，經(jīng)初步特異性檢測為陽性的克隆菌落后測序，并對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接，比對(duì)，校正，分析HBV基因核苷酸差異、變異類型。⑸選取一例H

4、BV RT區(qū)發(fā)生經(jīng)典變異的樣本，并以該樣本T-f1、T-f2為模板，設(shè)計(jì)含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增回收RT片段，與克隆載體pMD18 Tsimple vecter連接，測序驗(yàn)證后，將RT片段酶切回收，亞克隆入pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pc-RT。⑹用200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml6個(gè)新霉素濃度梯度作用于CHO細(xì)胞，鏡

5、下觀察選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低新霉素濃度。⑺將重組質(zhì)粒pc-RT在陽性脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，6小時(shí)后加入帶有新霉素篩選濃度的培養(yǎng)液，24小時(shí)后檢測RT區(qū)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。⑻對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用大三陽陽性血清介導(dǎo)的IFA和Western blot檢測HBV RT區(qū)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①在P區(qū)基因的反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)，有幾處需關(guān)注的變異情況(兩例及以上出現(xiàn)的變異)，可能為引起CHB患者耐藥變異的位點(diǎn)。②經(jīng)濃度梯

6、度遞倍稀釋等篩選，最后確定CHO細(xì)胞對(duì)新霉素的最佳篩選濃度為700ug/ml。③IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下，陽性表達(dá)細(xì)胞在70％以上。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBV RT區(qū)蛋白在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　 結(jié)論：⑴上述慢性乙型肝炎患者應(yīng)用核苷(酸)類藥物治療過程中，P區(qū)出現(xiàn)幾處需關(guān)注的變異情況，有5例樣本與已報(bào)道的HBV RT區(qū)經(jīng)典變異位點(diǎn)相同，有6處氨基酸變異與已證實(shí)的位點(diǎn)有所不同，初步發(fā)現(xiàn)了與HBV耐