A族鏈球菌感染小鼠巨噬細(xì)胞初期通過TLR4-MyD88直接途徑誘導(dǎo)SOCS-1高表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:巨噬細(xì)胞是抗感染的重要力量，通過其表面模式識別受體(PRR)識別細(xì)菌表面的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)而活化，TLR是重要的PRR，可以識別結(jié)合多種病原菌成分而活化巨噬細(xì)胞。當(dāng)TLR與PAMPs結(jié)合后，受體發(fā)生二聚體化，招募MyD88分子，MyD88分子中的DD結(jié)構(gòu)域招募其下游的IRAK并活化，從而激活TRAF6，引起NF-κB活化。被活化的NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與DNA序列上的特異蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)特定基因mRNA轉(zhuǎn)錄，翻譯產(chǎn)

2、生蛋白質(zhì)。巨噬細(xì)胞的活性還受到多種負(fù)調(diào)控蛋白的影響，其中細(xì)胞因子信號抑制蛋白(suppressor of cytokinesignaling，SOCS)即為可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化、以保證免疫應(yīng)答適可而止的重要分子。在許多免疫細(xì)胞中都已發(fā)現(xiàn)SOCS巨大的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。SOCS由至少8種成分組成，即SOCS1-7和CIS。其中，SOCS-1主要通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體結(jié)合，進(jìn)而激活JAK/STAT途徑產(chǎn)生。已有資料表明，一些細(xì)胞因子的活化，

3、如IFN-β，IL-10，IL-2和集落刺激因子都可以誘導(dǎo)SOCS-1的產(chǎn)生，其中干擾素受體途徑是其激活的經(jīng)典途徑，當(dāng)干擾素和其位于細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合后，激活受體相關(guān)的酪氨酸激酶(JAK-1 and TyK2)，隨后STAT1被磷酸化激活，并轉(zhuǎn)位入核，活化SOCS-1靶基因，表達(dá)SOCS-1蛋白。近幾年有資料報(bào)道，SOCS-1還可以通過TLR，Dectin-1等通路被誘導(dǎo)產(chǎn)生，LPS、CpG、酵母多糖等是它的刺激劑。
　　目

4、前，越來越多的研究提示，微生物及寄生蟲的成分可以誘導(dǎo)SOCS蛋白的產(chǎn)生，并以此下調(diào)免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而逃避機(jī)體的免疫攻擊。A群鏈球菌(GAS)可以導(dǎo)致咽炎、軟組織感染和其他許多呼吸道感染。GAS感染可以激活巨噬細(xì)胞膜表面的TLR2、TLR4等模式識別受體，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α及IFN-β等產(chǎn)生，但GAS之所以能在人群中持續(xù)存在并引起一些嚴(yán)重的感染性疾病，與其具有逃避宿主免疫攻擊的能力密切相關(guān)，一個(gè)常見的現(xiàn)象就是

5、GAS感染的嚴(yán)重壞死部位的一線防御細(xì)胞數(shù)量極少。因此為了進(jìn)一步了解GAS下調(diào)炎癥因子的分泌的策略，從而探索SOCS-1的產(chǎn)生機(jī)制，因此，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):1、檢測GAS感染小鼠巨噬細(xì)胞初期SOCS-1蛋白的表達(dá)情況。2、鑒于細(xì)胞因子受體活化通路是誘導(dǎo)SOCS-1的經(jīng)典通路，通過放線菌酮（抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成）作用于巨噬細(xì)胞再行GAS感染，以此檢測細(xì)胞因子對于SOCS-1產(chǎn)生的影響。3、細(xì)胞因子IFN-β活化通路是誘導(dǎo)SOCS-1的經(jīng)

6、典通路，因此，用IFN-β特異性中和抗體進(jìn)行阻斷，以此驗(yàn)證IFN-β在GAS感染誘生SOCS-1蛋白發(fā)揮的作用。4、另外，已有許多研究證明通過TLR途徑可以直接誘導(dǎo)SOCS-1的表達(dá)，但其機(jī)制并不清楚。因此，我們檢測了GAS感染小鼠巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞表面TLR2和TLR4的活化情況，進(jìn)而研究TLR信號通路與SOCS-1產(chǎn)生的關(guān)系。5、利用抑制劑、基因敲除鼠等手段研究TLR4、MYD88、NF-κB等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白在GAS誘導(dǎo)SOCS-1產(chǎn)生

7、中的作用。6、鑒于NF-κB是一種多向性基因調(diào)控蛋白，調(diào)節(jié)多種參與免疫反應(yīng)及免疫相關(guān)分子的基因轉(zhuǎn)錄過程，因此，通過對NF-κB活性的阻斷研究以此證明NF-κB在SOCS-1表達(dá)中的調(diào)控作用。
　　本研究豐富了對細(xì)菌與免疫細(xì)胞相互作用方式、機(jī)制的認(rèn)識，特別是豐富了對微生物誘發(fā)宿主細(xì)胞快速的、直接的表達(dá)負(fù)調(diào)控因子進(jìn)行逃逸固有免疫機(jī)制的了解，有助于拓寬抗感染免疫措施的建立與發(fā)展。
　　方法:
　　1、A族鏈球菌以MOI100

8、∶1感染鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7\小鼠骨髓來源BMDMs，誘導(dǎo)產(chǎn)生SOCS-1的特征。
　　2、放線菌酮處理巨噬細(xì)胞后感染GAS菌株，初步確定GAS誘導(dǎo)產(chǎn)生SOCS-1與細(xì)胞因子途徑的關(guān)系。
　　2.1檢測GAS組，熱滅活GAS組的細(xì)胞因子IFN-β表達(dá)情況（實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測）。
　　2.2用IFN-β的特異性抗體阻斷其活化后，檢測JAK/STAT通路及SOCS-1的產(chǎn)生情況。
　　2.3放線菌酮提前作用

9、巨噬細(xì)胞30分鐘后，加入GAS作用1小時(shí)后，去除GAS，在放線菌酮作用下繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，通過RT-PCR，Western blot檢測SOCS-1的產(chǎn)生情況，以及JAK/STAT通路的活化情況。
　　3、確定GAS感染巨噬細(xì)胞引起SOCS-1表達(dá)與巨噬細(xì)胞TLR4受體的關(guān)系。
　　3.1檢測GAS組，熱滅活GAS組的模式識別受體TLR2/TLR4表達(dá)情況（實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證）。
　　3.2以TLR4特異性阻斷劑提前

10、30分鐘作用巨噬細(xì)胞后，GAS MOI100(∶)1感染巨噬細(xì)胞1小時(shí)，去除細(xì)菌，在特異性阻斷劑存在的情況下繼續(xù)培養(yǎng)6h后檢測JAK/STAT通路的活化及SOCS-1的表達(dá)情況。
　　3.3分離TLR4基因敲除鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDMs)，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TLR4與SOCS-1產(chǎn)生的關(guān)系。
　　4、確定GAS誘導(dǎo)SOCS-1高表達(dá)與TLR4/MyD88傳導(dǎo)通路的關(guān)系。
　　4.1通過免疫熒光及免疫共沉淀技術(shù)檢測巨噬

11、細(xì)胞中MyD88，JAK1，STAT1蛋白存在的狀態(tài)。
　　4.2根據(jù)以上結(jié)果，在確定MyD88分子和JAK1，STAT1在巨噬細(xì)胞中以復(fù)合物的形式存在的前提下，用GAS感染時(shí)，用免疫熒光和免疫共沉淀的方法檢測這個(gè)復(fù)合物被活化的情況。
　　4.3用放線菌酮去除細(xì)胞因子的作用后，用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證TLR4/MyD88直接通路的存在。
　　4.4分離MYD88基因敲除鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)，GAS感染，進(jìn)一

12、步確證TLR4/MyD88直接通路的存在。
　　5、NF-κB活化對GAS誘導(dǎo)的SOCS-1表達(dá)中的影響作用研究
　　5.1小鼠巨噬細(xì)胞感染GAS后，經(jīng)過1h，2h，4h，6h檢測NE-κB活化情況，并同時(shí)檢測JAK/STAT通路蛋白的表達(dá)及活化情況，初步確定JAK/STAT通路的活化與NF-κB活化的關(guān)系。
　　5.2根據(jù)以上結(jié)果，利用NF-κB活化的特異性阻斷劑阻斷后，檢測JAK/STAT通路上JAK，STAT蛋白

13、的表達(dá)及活化情況，以及SOCS-1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、GAS感染巨噬細(xì)胞早期誘導(dǎo)SOCS-1大量表達(dá)
　　以MOI100∶1菌量的A族鏈球菌(GAS)、熱滅活的GAS(nonviableGAS)分別刺激小鼠來源的巨噬細(xì)胞系RAW264.7和BMDMs1小時(shí)，SOCS-1的表達(dá)特征:GAS感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后2小時(shí)SOCS-1基因開始有明顯的升高，6小時(shí)達(dá)到高峰，8小時(shí)開始下降;同時(shí)對照組熱失活G

14、AS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞SOCS-1 mRNA則在感染過后6-8小時(shí)開始輕度升高，且升高的幅度明顯小于GAS組。在GAS感染BMDM細(xì)胞時(shí)，SOCS-1 mRNA的表達(dá)情況基本和RAW264.7細(xì)胞一致，只是反應(yīng)的強(qiáng)度大于RAW264.7細(xì)胞。Western Blot檢測GAS引起SOCS-1蛋白在感染6小時(shí)后開始表達(dá)，而熱滅活得GAS基本在10h內(nèi)沒有表達(dá)。
　　2、GAS感染小鼠巨噬細(xì)胞早期引起SOCS-1表達(dá)部分依賴

15、于細(xì)胞因子IFN-β途徑
　　2.1 GAS感染RAW264.7細(xì)胞2小時(shí)IFN-β開始升高，6小時(shí)達(dá)到高峰。
　　2.2通過anti-IFN-β與GAS共培養(yǎng)，檢測SOCS-1，結(jié)果表明，IFN-β活化途徑可以引起SOCS-1的產(chǎn)生，但其并不是唯一途徑。
　　2.3為了檢測是否為其他細(xì)胞因子活化引起SOCS-1的表達(dá)，加入放線菌酮（抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的翻譯，阻斷細(xì)胞因子分泌）共培養(yǎng)，結(jié)果表明加入CHX后STAT1依然

16、能被磷酸化活化，表明GAS感染誘導(dǎo)SOCS-1表達(dá)產(chǎn)生除了部分依賴于細(xì)胞因子活化外，還存在一條直接刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生SOCS-1的途徑。
　　3、GAS感染巨噬細(xì)胞后TLR4活化情況
　　GAS感染RAW264.7細(xì)胞后，位于細(xì)胞膜表面的TLR2和TLR4被活化。在感染發(fā)生后4小時(shí)，TLR4的表達(dá)升高到了峰值，為正常的8倍左右，在感染后6小時(shí)其表達(dá)開始下降;而對照組熱滅活處理的GAS感染巨噬細(xì)胞6小時(shí)內(nèi)TLR4的表達(dá)沒有升高;

17、而細(xì)胞膜表面的TLR2在感染發(fā)生6小時(shí)內(nèi)GAS組和熱失活GAS組基本沒有區(qū)別，都在感染后4小時(shí)達(dá)到峰值，并且升高幅度基本一致。
　　4、TLR4參與了GAS感染引起的SOCS-1的表達(dá)
　　4.1為了確定巨噬細(xì)胞表面TLR4的激活是否參與了SOCS-1的表達(dá)，我們用TLR4的中和抗體提前封閉巨噬細(xì)胞表面的TLR4，再行GAS感染，結(jié)果顯示，封閉巨噬細(xì)胞TLR4后， GAS感染引起的SOCS-1表達(dá)量明顯降低，由此證明位于巨噬

18、細(xì)胞表面TLR4在GAS感染引起SOCS-1表達(dá)方面發(fā)揮了重要作用。
　　4.2 GAS感染TLR4-/-小鼠BMDMs細(xì)胞，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TLR4在誘導(dǎo)SOCS-1表達(dá)中發(fā)揮的重要作用。
　　5、SOCS-1表達(dá)呈MyD88分子依賴性
　　5.1免疫熒光染色和免疫共沉淀結(jié)果表明，在RAW264.7細(xì)胞中MyD88，JAK1，STAT1是以復(fù)合體的形式存在的。當(dāng)GAS感染發(fā)生后，與MyD88結(jié)合的JAK1蛋白迅速發(fā)生

19、磷酸化，在感染后1-2小時(shí)達(dá)到高峰，隨后復(fù)合物中的STAT1開始發(fā)生磷酸化激活，在3小時(shí)達(dá)到峰值。
　　5.2 GAS刺激MyD88-/-BMDMs細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)SOCS-1表達(dá)缺失。
　　5.3 CHX阻斷細(xì)胞因子后，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)結(jié)合于MyD88分子上的STAT1依然被活化，由此進(jìn)一步證明了感染早期，GAS本身可以通過直接激活結(jié)合于MyD88分子上的STAT，從而引起SOCS-1蛋白的快速表達(dá)。
　　

20、6、NF-κB信號通路通過調(diào)控STAT1表達(dá)影響SOCS-1蛋白
　　6.1 GAS刺激巨噬細(xì)胞后，引起NF-κB被活化及STAT1蛋白表達(dá)增加，且STAT1表達(dá)增加落后于NF-κB的活化，說明NF-κB的活化可能影響STAT1的表達(dá)。
　　6.2通過NF-κB信號通路阻斷劑JSH-23作用后檢測發(fā)現(xiàn)，STAT1的表達(dá)明顯降低，進(jìn)而磷酸化STAT1及SOCS-1蛋白的表達(dá)水平大大降低。
　　結(jié)論:
　　1、GAS