A族鏈球菌上調巨噬細胞負調節(jié)因子A20表達的菌體成分以及作用機制研究.pdf

1、目的:
　　 A群鏈球菌(GroupAstreptococcus，GAS)是常見的人類致病菌，能夠引起各種化膿性感染性疾病，包括咽炎、扁桃體炎等輕型感染，以及感染后的自身免疫病、致死率很高的毒素性疾病，如風濕熱、風濕性心臟病、免疫性腦病、牛皮癬、腎小球腎炎以及毒性休克綜合征、猩紅熱等，嚴重威脅人體健康。機體試圖利用免疫防御功能清除細菌，阻斷感染，但由于鏈球菌有強大的免疫逃逸能力，所以鏈球菌感染表現(xiàn)為遷延及反復感染狀態(tài)。目前，研究

2、表明GAS的免疫逃逸表現(xiàn)在多方面，一方面是細菌依靠本身的毒力因子，包括M蛋白、Fba、SpeB等因素進行免疫逃逸;另一方面是GAS通過與宿主的相互作用，消弱或抑制宿主免疫防御功能而進行免疫逃逸。固有免疫是機體的第一道防線，是特異性免疫的基礎，巨噬細胞是一類重要的執(zhí)行固有免疫的細胞，它以模式識別受體識別、結合細菌的病原相關分子模式，通過信號傳導通路致細胞活化，以多種機制殺死和清除細菌。而GAS在免疫逃逸過程中進化出各種策略，挑戰(zhàn)固有免疫細

3、胞的清除作用，上調宿主細胞免疫負調節(jié)因子就是其免疫逃逸的重要手段之一。NF-κB通路是巨噬細胞激活的重要通路，調節(jié)此通路的的免疫抑制分子有多種，如MyD88s、SHIP1、RP105、IRAK-MTollip、A20、TRAILR、SOCS-1、NOD2、C5a、Stlr、SIGIRR和RIP3等，這些分子的調控機制各不相同，但最終都能對NF-κB信號通路起負調節(jié)作用。本室前期工作已證實，GAS可以誘導鼠巨噬細胞(MΦ)產生高水平的免疫

4、負調節(jié)因子A20，本研究在此基礎上聚焦于上調A20表達的GAS菌體成分以及作用機制的研究。
　　 A20為鋅指蛋白，又稱為腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(tumornecrosisfactoralphainducedprotein3，TNFAIP3)，也稱作腫瘤壞死因子α誘導蛋白A20(tumornecrosisfactor,alphainducedproteina20，TNFAIPA20)。作為負調控因子，A20能在多種組織細胞內誘

5、導表達，表達刺激因素包括細胞因子如腫瘤壞死因子、IL-1、CD40等，其他還有佛波醇酯、過氧化氫、細菌和病毒以及它們的代謝產物脂多糖、EB病毒潛伏膜蛋白1等。A20的調節(jié)作用表現(xiàn)為對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、細胞間黏附分子等多種促炎因子的過度釋放以及對細胞凋亡和壞死明顯的抑制作用。
　　 A20在發(fā)揮調控功能時主要利用其雙重泛素化酶功能，使胞漿中相關信號通路的多種關鍵蛋白分子泛素化，進而被蛋白酶體識別，加速降解，

6、達到抑制信號通路的作用，抑制促炎因子的表達，增加抗炎因子的表達。在NF-κB信號通路中，A20靶向關鍵的上游成分，如RIP1和TRAF6，使它們泛素化降解，最終引起炎癥通路的抑制。本室前期工作雖已證實GAS與MΦ作用后上調表達A20，但A20的表達變化特征如何？何為誘導A20表達的GAS相關成分？為解釋這些問題，本課題進行了以下一些探索，首先觀察GAS作用于RAW264.7細胞致A20表達的特征，再通過構建M蛋白和SpeB基因缺失菌分析

7、上調A20表達致免疫逃逸的菌體成分，并通過相應的通路分析初步探索A20調控的機制。
　　 方法:
　　 1、檢測GAS作用于RAW264.7細胞致A20蛋白表達特征:用3個不同濃度的GAS菌(MOI=10∶1、50∶1、100∶1)感染RAW264.7細胞，設感染后0.5h、2h、4h、6h、8h、12h刺激孔，行Westernblot檢測不同濃度GAS菌作用于RAW264.7細胞A20蛋白表達動態(tài)變化特征。
　　

8、 2、GAS致RAW264.7細胞A20表達機制研究:
　　 2.1、Real-timePCR和免疫組化法檢測GAS刺激RAW264.7細胞后，炎癥因子TNF-αmRNA和蛋白的表達變化。
　　 2.2、用放線菌酮阻斷后再行GAS刺激RAW264.7細胞，免疫組化法檢測TNF-α，Westernblot法檢測A20。
　　 2.3、用TNFR1抗體阻斷后再行GAS刺激RAW264.7細胞，Westernblot

9、檢測A20蛋白的表達變化。
　　 2.4、Westernblot檢測基因敲除鼠MyD88-BMDM細胞受GAS刺激后A20的表達變化。
　　 3、構建SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突變菌:先構建重組同源片段自殺質粒pFW5/△SpeB和pFW5/△M,再經電轉化構建基因突變菌SpeB-/-GAS、M-/-GAS并鑒定。
　　 4、GAS基因突變菌與野生菌作用于RAW264.7細胞致A20及NF-κB通路

10、相關分子的表達差異分析:
　　 4.1、wtGAS、SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細胞后，分別用Real-timePCR和Westernblot檢測A20mRNA與蛋白表達。
　　 4.2、Westernblot檢測wtGAS、SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細胞后，NF-κB通路分子TRAF6和P65的表達差異。
　　 4.3、Real-

11、timePCR方法分析SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突變菌與wtGAS作用于RAW264.7細胞后，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達差異。
　　 5、Westernblot檢測wtGAS、SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突變菌作用于小鼠BMDM細胞，A20及其調控的NF-κB通路中TRAF6和P65的表達差異。
　　 結果:
　　 1、GAS菌作用于RAW264.7細胞致A20蛋白表

12、達的特征:低濃度菌量(MOI=10∶1)感染時，RAW264.7細胞的A20表達量從感染后2h直至12h維持高水平。中濃度(MOI=50∶1)感染，表達高峰在感染后6h，比低濃度出現(xiàn)晚且維持時間短。高濃度(MOI=100∶1)感染，A20的表達量在2h內雖然有所上升，但表達水平低。
　　 2、A20表達與TN-α通路的關系:Real-timePCR檢測顯示RAW264.7細胞感染GAS后TNF-α的表達水平隨時間變化逐漸增強（p

13、＜0.05）;放線菌酮阻斷RAW264.7細胞后再感染GAS菌，TNF-α能被有效阻斷;放線菌酮阻斷RAW264.7細胞后，在GAS菌刺激下A20蛋白表達明顯減少，說明A20是炎癥因子依賴性表達。進一步以TNFR1抗體阻斷RAW264.7細胞，接受GAS刺激后A20蛋白表達明顯低于陽性對照組，但高于正常對照組，提示TNFR1活化通路可以部分誘導A20。
　　 3、MyD88基因敲除鼠的BMDM細胞在GAS菌刺激下，Western

14、blot檢測A20蛋白無表達，提示GAS致巨噬細胞A20表達為MyD88依賴性。
　　 4、成功構建了pFW5/△SpeB與pFW5/△M重組自殺質粒，經電轉化GAS菌構建了SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突變菌并通過了鑒定。用M-/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細胞后，分別用Real-timePCR和Westernblot檢測A20mRNA與蛋白表達，與野生菌GAS（wtGAS）作用相比，M-/-GAS使RA

15、W264.7細胞A20mRNA(p＜0.01)與蛋白表達均下降，而SpeB-/-GAS使RAW264.7細胞A20mRNA(p＜0.01)與蛋白表達呈上升趨勢。
　　 5、不同菌株(wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS)致RAW264.7細胞A20表達變化過程中，A20作用通路內相應信號分子表達的變化:用wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS分別刺激RAW264.7細胞后在1h、2h、4h、6h、8h幾個時

16、間點動態(tài)觀察底物TRAF6及其下游P65蛋白表達，發(fā)現(xiàn)各組內TRAF6及P65隨時間進展表達均增加，說明不論成分缺失與否，炎癥反應隨著時間變化逐漸增強。與wtGAS刺激組對比，M-/-GAS刺激組的TRAF6及P65表達處于較高水平，而SpeB-/-GAS基因缺失菌TRAF6及P65表達則減少，與缺失菌刺激A20變化吻合。
　　 6、不同菌株(wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS)作用于RAW264.7細胞后，細胞因

17、子的表達變化。用M-/-GAS、SpeB-/-GAS作用于RAW264.7細胞后，Real-timePCR檢測細胞因子表達:與wtGAS作用比較，M-/-GAS刺激組IL-1β、IL-6mRNA水平明顯高于wtGAS刺激組(p＜0.01)，有顯著差異;TNF-αmRNA的表達水平則比wtGAS刺激組低。而SpeB-/-GAS刺激組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達與wtGAS刺激組接近。經細胞因子的表達變化趨勢分析，發(fā)現(xiàn)細胞因子變化

18、與相應組A20的表達一致，呈負相關。
　　 7、不同菌株(wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS)致鼠源BMDM細胞的A20及TRAF6、P65蛋白表達差異。分別行Westernblot檢測分析，在2h、4h、6h幾個時間點動態(tài)觀察A20及TRAF6、P65蛋白表達差異，與野生菌刺激組相比，各組BMDM細胞的A20及TRAF6、P65蛋白表達特性及趨勢與RAW264.7細胞相同。
　　 結論:
　　 1