TLR4-MyD88通路在DFMG抗LPC誘導(dǎo)人內(nèi)皮細胞損傷中的作用.pdf

1、目的:
　　探討一種新型活性化合物，7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀異黃素(7-difluoromethoxy-5,4'-dimethoxygenistein，DFMG)，是否通過抑制TLR4-MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC-12）氧化應(yīng)激損傷。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)HUVEC-12細胞，TLR4-cDNA

2、質(zhì)粒和TLR4-shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞24h得到TLR4過表達HUVEC-12細胞和TLR4沉默HUVEC-12細胞。用RT-qPCR和Western blotting鑒定是否分別成功過表達和沉默TLR4。用30μmol/L的LPC處理以上兩種細胞24 h，然后加入3.0μmol/L的DFMG孵育24h。應(yīng)用ELISA分析DFMG對LPC誘導(dǎo)損傷的HUVEC-12細胞TLR4-MyD88通路途徑中IL-6、TNF-α的影響，采用We

3、stern blotting檢測DFMG對于LPC誘導(dǎo)損傷的HUVEC-12細胞TLR4-MyD88通路途徑中TLR4、MyD88的影響。
　　結(jié)果:
　?、賂LR4-cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，相對于空白對照組，熒光定量PCR結(jié)果顯示TLR4過表達組細胞的TLR4基因表達增加(P＜0.01)，Westernblotting結(jié)果顯示TLR4過表達HUVEC-12細胞的TLR4蛋白表達增加。TLR4-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，相對于空白對

4、照組，熒光定量PCR結(jié)果顯示TLR4沉默HUVEC-12細胞的TLR4基因表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western blotting結(jié)果顯示TLR4沉默HUVEC-12細胞的TLR4蛋白表達明顯降低。驗證TLR4-cDNA質(zhì)粒和TLR4-shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染后獲得TLR4過表達HUVEC-12細胞和TLR4沉默HUVEC-12細胞。
　?、贓LISA結(jié)果顯示:LPC損傷組、TLR4過表達組和TLR4過表達

5、+LPC損傷組的IL-6、TNF-α分泌量相對空白對照組均明顯上升(P＜0.05)，其中TLR4過表達+LPC損傷組增高最為顯著(P＜0.05）。TLR4沉默組和TLR4沉默+LPC損傷組的IL-6、TNF-α分泌量較LPC損傷組均明顯下降(P＜0.05）。TLR4過表達+LPC損傷+DFMG組的IL-6、TNF-α表達量與TLR4過表達+LPC損傷組比較顯著下降(P＜0.05）。TLR4沉默+LPC損傷+DFMG組的IL-6、TNF-

6、α表達量與TLR4沉默+LPC損傷組和LPC損傷組比較均明顯下降(P＜0.05）。DFMG組的IL-6、TNF-α分泌量同空白對照組相當，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　?、踂estern blotting結(jié)果顯示:LPC損傷組、TLR4過表達組和TLR4過表達+LPC損傷組的TLR4、MyD88蛋白表達量相對空白對照組有所上升，其中TLR4過表達+LPC損傷組上升最為明顯。TLR4沉默組和TLR4沉默+LPC損傷組所表達的

7、TLR4、MyD88蛋白相對于LPC損傷組明顯下降。TLR4過表達+LPC損傷+DFMG組的TLR4、MyD88蛋白表達量與TLR4過表達+LPC損傷組比較顯著下調(diào)。而TLR4沉默+LPC損傷+DFMG組比TLR4沉默+LPC損傷組和LPC損傷組的TLR4、MyD88蛋白量都明顯減少。DFMG組的TLR4、MyD88蛋白表達量與空白對照組差異不明顯。
　　結(jié)論:
　?、賂LR4-MyD88信號通路介導(dǎo)LPC誘導(dǎo)的HUVEC-