乙酰膽堿受體四聚體前體α-亞單位在HEK293細(xì)胞膜上的表達(dá).pdf

1、目的：乙酰膽堿受體四聚體前體α亞單位（pcDNA3.1-AchRα-BirA）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞（HEK293）并在其細(xì)胞膜上獲得穩(wěn)定表達(dá)。為構(gòu)建乙酰膽堿受體四聚體并將其作為抗原用于檢測乙酰膽堿受體抗體的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-AchRα-BirA，將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α中。擴(kuò)增培養(yǎng)E. coli DH5α，提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1-AchRα-BirA，經(jīng)限

2、制性核酸內(nèi)切酶EcoRV單酶切后，采用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步確定提取到質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，經(jīng)生物公司合成并測序，驗(yàn)證其基因序列。將成功提取到的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-AchRα-BirA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。經(jīng)G418篩選后，形成集落狀抗性克隆細(xì)胞。將表達(dá)產(chǎn)物擴(kuò)大培養(yǎng)，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，以異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，經(jīng)熒光顯微鏡查看表達(dá)情況。
　　結(jié)果：電泳檢查發(fā)現(xiàn)了大小約為6964bp的條帶，并經(jīng)生