重組人乙酰膽堿受體亞單位誘導(dǎo)眼肌型重癥肌無力的實驗研究.pdf

1、第一章重組H-AChRγ亞單位免疫誘導(dǎo)眼肌型重癥肌無力模型的建立
　　 目的:觀察E.coli質(zhì)粒表達(dá)重組人乙酰膽堿(human acetylcholinereceptor，H-AChR)γ亞單位免疫誘導(dǎo)HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠眼肌型實驗性自身免疫性重癥肌無力(ocular experimental autoimmunemyasthenia gravis，oEAMG)模型的建立并探討oEAMG模型的特點(diǎn)，明確乙酰膽堿受體抗體（a

2、cetylcholine receptor antibody，AChR-Ab）在oEAMG發(fā)病機(jī)制中的作用和特點(diǎn)。
　　 方法:HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠27只，隨機(jī)平均分成H-AChRγ亞單位免疫組，E.Coli.提取物免疫組，CFA免疫組，用乳化于CFA的重組H-AChRγ亞單位，或E.Coli提取物，或純CFA分別于0，30，60天免疫。第二次免疫后，每周進(jìn)行一次小鼠眼部和全身癥狀評估，小鼠肌肉握力測量，實驗結(jié)束前進(jìn)行小鼠前

3、庭眼反射檢測。第二次免疫后第15天和45天收集小鼠血清，RIA檢測小鼠血清AChR-Ab水平，ELISA檢測小鼠血清中IgG、 IgG1、IgG2b、IgG2c、 IgM水平。
　　 結(jié)果:H-AChRγ亞單位免疫組9只小鼠中8只(89％)出現(xiàn)眼部癥狀，6只小鼠有完全上瞼下垂癥狀，9只小鼠中6只(67％)小鼠出現(xiàn)輕度的全身癥狀（1級），而E.coli免疫組，CFA免疫組無明顯眼部表現(xiàn)及全身肌力減退癥狀，H-AChRγ亞單位免疫組

4、眼部及全身臨床癥狀嚴(yán)重度評分明顯高于其它兩組（P均＜0.001）;第二次免疫后35天起，H-AChRγ亞單位免疫組小鼠肌肉握力與E.coli免疫組，CFA免疫組兩組比較具有顯著性差異(P均＜0.05），H-AChRγ亞單位免疫組小鼠肌肉握力在實驗終止前降至最低;與E.coli免疫組，CFA免疫組兩組相比，H-AChRγ亞單位免疫組小鼠水平維度的視動反應(yīng)增益明顯下降(P均＜0.05）;第二次免疫后15，45天，H-AChRγ亞單位免疫組小

5、鼠血清中AChR-Ab和抗—AChR Ig(IgM、IgG、Ig2b、Ig2c、IgG1)水平均明顯高于E.coli免疫組，CFA免疫組，差別有顯著性（P均＜0.001）。
　　 結(jié)論:重組H-AChRγ亞單位能成功誘導(dǎo)小鼠oEAMG模型，AChR-Ab在誘導(dǎo)oEAMG發(fā)生和發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第二章重組H-AChRγ亞單位免疫誘導(dǎo)眼肌型重癥肌無力模型免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究
　　 目的:探討重組H-AC

6、hRγ亞單位免疫誘導(dǎo)下oEAMG的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。
　　 方法:HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠用乳化于CFA的重組H-AChRγ亞單位，或E.Coli提取物，或純CFA分別免疫，免疫后第8天后，取淋巴結(jié)和脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，3H-TdR摻入法檢測淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，收集培養(yǎng)上清液用ELISA檢測IL-2，IFN-γ，IL-6，IL-10水平。第3次免疫后30天，流式細(xì)胞儀觀察各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中CD4+CD25+細(xì)胞和CD19+細(xì)胞百

7、分比變化，免疫熒光法檢測3組小鼠眼外肌(extraocular muscle， EOM)和后肢肢體肌(limb muscle，LM)神經(jīng)肌肉結(jié)點(diǎn)處(neuromuscularj unction，NMJ) IgG或補(bǔ)體沉積情況，RT-PCR法檢H-AChRγ亞單位免疫組和CFA免疫組小鼠EOM和LM的AChRα，γ和ε亞單位mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　 結(jié)果:H-AChRγ亞單位免疫組小鼠淋巴結(jié)和脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著高于E.C

8、oli提取物或CFA免疫組（P均＜0.05），ELISA顯示H-AChRγ亞單位免疫組小鼠淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中IL-2，INF-γ水平顯著均高于E.coli提取物和CFA免疫組(P＜0.05），IL-6，IL-10水平與E.coli提取物和CFA免疫組相比均無顯著差異(P均＞0.05）。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，H-AChRγ亞單位免疫組小鼠淋巴結(jié)和脾臟中CD4+CD25+細(xì)胞和CD19+細(xì)胞百分比顯著高于E.coli提取物和CFA免疫組(

9、P均＜0.05）。H-AChRγ亞單位免疫組小鼠EOM和LM NMJs處可見大量IgG，C3，和MAC沉積，而E.coli提取物和CFA免疫組小鼠NMJs未見IgG，C3，和MAC沉積(P均＜0.001）。與CFA免疫組相比，H-AChRγ亞單位免疫組小鼠EOM和LM的AChRα，γ和ε亞單位mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.05）。
　　 結(jié)論:H-AChRγ亞單位免疫能誘導(dǎo)oEAMG和gEAMG的發(fā)生與發(fā)展，

10、細(xì)胞免疫、體液免疫和補(bǔ)體等多種機(jī)制參與其發(fā)病。
　　 第三章重組H-AChRε亞單位免疫原性誘導(dǎo)眼肌型重癥肌無力發(fā)病可能性研究
　　 目的:觀察H-AChRε亞單位免疫原性在眼肌型重癥肌無力發(fā)病機(jī)理中的作用，進(jìn)一步探討AChR亞單位誘導(dǎo)產(chǎn)生的自身免疫反應(yīng)與oMG和oEAMG的關(guān)系。
　　 方法:通過PT-PCR檢測HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠出生后0，1，2，4周EOM和LM的AChRα，γ和ε亞單位表達(dá)水平變化。H

11、LA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠用乳化于CFA的重組H-AChRε亞單位，或E.Coli提取物，或純CFA分別于0，30，60天免疫，第二次免疫后每周進(jìn)行一次小鼠眼部和全身癥狀評估，小鼠肌肉握力測量，第二次免疫后第45天收集小鼠血清，RIA檢測小鼠血清中AChR-Ab水平，ELISA檢測小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgM水平，第3次免疫后30天，免疫熒光法檢測小鼠NMJ處IgG或補(bǔ)體沉積情況。
　　 結(jié)果:EOM的

12、AChRα，γ和ε亞單位的mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨出生后時間的增加無明顯改變（P均＞0.05），在出生后第0周小鼠LM的中可見AChRγ亞單位的表達(dá)，無AChRε亞單位的表達(dá)，出生后第1周LM中，AChRγ亞單位的表達(dá)消失，出現(xiàn)AChRε亞單位的表達(dá)，而α亞單位表達(dá)無明顯變化（P均＞0.05）。H-AChRε亞單位免疫組9只小鼠中3只(33％)有眼部癥狀，2只(22％)小鼠有輕度的全身癥狀（1級），而E.coli免疫組，CFA免疫組無明顯眼部

13、和全身改變，H-AChRε亞單位免疫組眼部和全身臨床癥狀嚴(yán)重度評分明顯高于其它兩組(P均＜0.05）。H-AChRε亞單位免疫組小鼠平均肌力與E.coli免疫組，CFA免疫組兩組比較無顯著性差異（P均＞0.05）。第二次免疫后45天，H-AChRε亞單位免疫組小鼠血清中AChR-Ab和抗—AChR Ig(IgM、IgG、Ig2b、Ig2c、IgG1)水平均明顯高于E.coli免疫組、CFA免疫組（P均＜0.01）。有明顯眼部和全身癥狀的